慢性HCV感染患者PBMC体外Th1类细胞因子分泌及其相关因素分析

　作者：李跃旗，许鹏辉，苏海滨 ，迟淑萍，朱雷，戚扬，李金波，程云
　　【摘要】 目的：研究慢性HCV(丙型肝炎病毒)感染患者外周血单个核细胞(PBMC)体外Th1类细胞因子的分泌，进一步了解HCV感染慢性化和肝损伤机制. 方法：体外培养慢性HCV感染患者PBMC 72 h后，ELISA检测培养上清Th1类细胞因子(IL2，IFNγ，TNFα)，荧光定量PCR检测患者血清HCV RNA含量，RTPCR检测HCV RNA亚型. 结果：与正常人相比，IFNγ在HCV RNA阴性患者中明显增高，而在RNA阳性患者中无明显升高. TNFα则不论RNA滴度的高低均较正常人显著增高. RNA阳性患者ALT(丙氨酸氨基转移酶)，AST(门冬氨酸氨基转移酶)水平明显高于阴性患者. 不同HCV基因型感染的患者IFNγ，TNFα的分泌无显著差异. 结论：IFNγ在清除病毒中起重要作用，TNFα是引起肝脏损伤的重要因素之一.

　　【关键词】 C型肝炎样病毒属
　　0引言

　　HCV(丙型肝炎病毒)感染后易于慢性化，但其慢性化机制仍不十分清楚. 有研究[1-2]表明，天然免疫、体液免疫以及细胞免疫均对病毒的清除有重要作用，而细胞免疫尤为重要. Th1类细胞因子是参与细胞免疫的重要物质，在细胞清除细胞内病原体的免疫应答过程中起关键作用，但同时也是诱发肝脏损伤的重要机制. 我们比较了HCV感染后体内不同病毒滴度及不同的基因型患者的外周血单个核细胞(PBMC)体外分泌Th1类细胞因子及肝脏的炎症情况，以进一步了解HCV感染慢性化和肝损伤机制.

　　1对象和方法
　　1.1对象收集我院2005年门诊或住院的慢性HCV感染患者44(男35，女9)例， 平均年龄42.3(15～67)岁，所有病例均符合2000年西安全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》慢性HCV感染诊断标准[3]. 对照10例为健康献血员. 淋巴细胞提取液、Trizol、细胞因子ELISA检测试剂盒(晶美公司);AMV(逆转录酶)，RNA酶抑制剂、dNTP，Taq酶(Promega公司);RPMI 1640母液(Gibico公司);GeneAMP5700型HCVRNA定量检测仪(美国ABI公司);AU600肝功能检测仪(Olympus公司);其他试剂均购自北京中生公司产品.

　　1.2方法

　　1.2.1外周血PBMC的提取采用Ficoll梯度离心法.

　　1.2.2PBMC体外培养后上清细胞因子的检测将分离所得PBMC用含有100 mL/L混合人血清的完全RPMI 1640培养液稀释细胞密度为5×109/L，以100 μL/孔加于96孔板，37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养，72 h后收集培养上清，-20℃冻存. 同时设不加细胞的阴性对照和加入ConA(刀豆蛋白，2 mg/L)刺激的阳性对照.

　　1.2.3检测项目全部病例采用荧光定量PCR检测HCV RNA滴度，肝功能检测由我院临床检验中心完成.

　　1.2.4血清HCV RNA基因分型参照文献[4]进行. Trizol提取血清中总RNA，逆转录合成cDNA，引物：5′ATGTACCCCATGAGGTCGGC3′. 巢式PCR进行RNA分型鉴定. 第1轮PCR引物：正义：5′CGCGCGACTAGGAAGACTTC 3′;反义：5′ATGTACCCCATGAGGTCGGC3′，94℃变性1 min，55℃复性1.5 min，72℃延伸2 min，35个循环. 第2轮PCR以第1轮PCR产物为模板，使用同一个正义引物和4个型特异性反义引物，正义：5′AGGAAGAC TTCCGAGGGGTC3′，反义：5′TGCCTTGGGGATAGGCTGAC3′(Ⅰ型，57 bp);5′GAGCCATCCTGCCCACCCCA 3′(Ⅱ型,144 bp);5′CCAAGAGGGACGGGAACCTA3′(Ⅲ型,174 bp);5′ACCCTCGTTTCCGTACAGAG 3′(Ⅳ,135 bp)，94℃变性1 min，60℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，30个循环. PCR产物15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.

　　统计学处理：用STATA7.0软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验.

　　2结果

　　2.1HCV感染患者PBMC体外培养72 h后Th1类细胞因子的分泌培养72 h后，对照及所有HCV患者PBMC培养上清中均未检测到IL2. HCV RNA阴性(RNA<106拷贝/L)患者IFNγ[(55±33) ng/L]较正常人[(34±14) ng/L ]和RNA大于109拷贝/L的患者[(29±20) ng/L]明显增高(图1)，而所有RNA阳性患者与对照相比无显著差异. TNFα不论RNA滴度高低均较对照显著增高;RNA不同滴度的患者间无显著差异.

　　2.2不同HCV RNA滴度情况下患者肝脏功能间的比较RNA阳性患者ALT，AST水平明显高于阴性患者(表1)，其余肝脏功能指标两组患者间无明显差异.

　　2.3不同HCVRNA基因型Th1类细胞因子的分泌对34例HCV RNA阳性患者进行HCV RNA分型，21例Ⅱ/1b(62%)，5例Ⅲ/2a(15%)，8例(23%)未分出(表2). 不论HCV RNA为何种基因型，PBMC体外培养后IFNγ的分泌都较对照组无显著差异，而TNFα则均较对照组明显增高. 但各基因型之间IFNγ，TNFα均无显著差异.

　　图1在不同HCV RNA滴度下的PBMC IFNγ和TNFα的分泌水平　略
　　表1不同HCV RNA滴度情况下患者的肝脏功能(略)

　　表2不同的HCV RNA基因型Th1类细胞因子的分泌(略)

　　3讨论

　　虽然HCV感染后可诱导机体产生特异性的抗体，但HCV感染仍倾向于慢性化，可能原因是HCV在免疫压力的诱导下中和性表位发生变异，致使已产生的抗体不能中和病毒[5]. 因此，细胞免疫在HCV感染后的清除过程中可能起到决定性作用[6]. 有研究表明，在感染HCV后自发清除病毒的患者中，其体内Th1类细胞因子(IFNγ，TNFα)的产生显著高于病毒持续存在的患者[7]. 此外，在HCV感染后不论是否清除病毒，均可诱导机体产生特异性的细胞免疫，但免疫应答的强度不足以清除病毒，从而致使病毒长期存在[8].

　　IFNγ主要由NK细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞分泌，可增强抗原提呈细胞的吞噬能力，促进MHCI，II类抗原的表达、IL12的分泌，诱导机体免疫应答向Th1类分化[9],同时其本身也具有抗病毒作用. 我们的实验表明，慢性HCV感染患者PBMC体外培养后，在HCVRNA阴性(<106拷贝/L)患者中，IFNγ，TNFα的产生明显高于正常人，而在HCVRNA阳性患者中，不论滴度的高低，TNFα均有所升高，但IFNγ的产生却与正常人无显著差异，且HCVRNA滴度越高，IFNγ的产生越低. 这在一定程度上表明，IFNγ在病毒清除中起重要作用，细胞因子(IFNγ，TNFα)分泌的不平衡可能是导致病毒不能清除的原因之一.

　　细胞免疫在HCV感染中具有双重作用，HCV感染后诱导机体产生的Th1类细胞因子(IFNγ，TNFα)虽然不足以清除病毒，但仍可诱导机体肝脏损伤[10]. IFNγ，TNFα同时具有抗病毒和明显的诱发炎症作用，在HCV感染后引起肝脏损伤中起重要作用. 我们的实验发现，在RNA阳性患者中，代表肝脏炎症指标的ALT，AST较RNA阴性患者明显增高，且TNFα也较正常人明显增高，表明RNA含量与病毒引起的肝脏损伤有一定关系，这可能由于在RNA阳性患者中，由于IFNγ分泌不足，单独的TNFα升高表现为肝损伤为主，但不足以清除病毒. 而在RNA阴性、肝功能正常的患者，虽然TNFα也明显增高，但IFNγ同时增高，二者一同起到了抗病毒的协同作用，体内病毒含量的减少使得肝脏炎症减轻. 另外，虽然RNA阴性患者表现为ALT，AST正常，但其诱导产生的免疫应答仍有可能造成损伤，肝脏炎症依然存在，病理检查将有助于进一步的明确.

　　在我国，HCV基因型Ⅱ/1b，Ⅲ/2a为主要感染病毒株，在我们的研究中基因型Ⅱ/1b，Ⅲ/2a占RNA阳性患者的76%,各基因型之间IFNγ，TNFα的分泌均无显著差异，提示慢性HCV感染后诱导产生的免疫应答与基因型无关.

　　【参考文献】
　　[1] Mizukoshi E, Rehermann B. Immune responses and immunity in hepatitis C virus infection[J]. J Gastroenterol， 2001， 36(12): 799-808.

　　[2] Thimme R, Lohmann V, Weber FA. Target on the move: Innate and adaptive immune escape strategies of hepatitis C virus[J]. Antiviral Res, 2006，69(3): 129–141.

　　[3] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志, 2000， 8(6)：249-250.

　　[4] Hiroaki O, Yasushi S, Shunichi O, et al. Typing hepatitis C rirus by polymerase chain reaction with typespecific primers: Application to clinical surveys and tracing infectious sources[J]. J General Virol, 1992， 73(3): 673-679.

　　[5] Pavio N, Lai MM. The hepatitis C virus persistence: how to evade the immune system? [J]. J Biosci, 2003， 28(3): 287-304.

　　[6] Christie JM, Healey CJ, Watson J, et al. Clinical outcome of ypogammaglobulinemic patients following outbreak of acute hepatitis C: 2 Year followup[J]. Clin Exp Immunol, 1997， 110(1): 4-8.

　　[7] Rosen HR, Miner C, Lewinsohn D, et al. Frequencies of HCVspecific effector CD4 T cells by flow cytometry: Correlation with clinical disease stages[J]. Hepatology, 2002， 35(1): 190-198.

　　[8] Rosen HR. Hepatitis C Pathogenesis: Mechanisms of Viral Clearance and Liver Injury[J]. Liver Transplant, 2003， 9(11): S35-S43.

　　[9] Szabo SJ, Sullivan BM, Peng SL, et al. Molecularmechanisms regulating Th1 immune responses[J]. Annu Rev Immunol, 2003， 21: 713-758.

　　[10] Sun J, Li K, Shata MT, et al. The immunologic basis for hepatitis C infection[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2004， 20(6): 598-602.