软坚消瘿汤对自身免疫性甲状腺炎凋亡蛋白Fas/FasL、Bcl-2／Bax表达的影响

作者：张兰,方振伟　　作者单位：辽宁中医药大学附属医院,辽宁,沈阳,100032

　　【摘要】 目的观察软坚消瘿汤对实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)大鼠的自身抗体、凋亡蛋白Fas/Fasl，Bcl-2/Bax的影响，从凋亡调控蛋白角度探讨其作用机制。方法运用甲状腺球蛋白与弗氏佐剂混合免疫注射法，联合饮用高碘水模拟大鼠实验性自身免疫性甲状腺炎。酶联免疫法检测甲状腺自身抗体、免疫组化染色法检测大鼠甲状腺细胞Fas/FasL，Bcl-2/Bax变化。结果软坚消瘿汤能显著降低自身免疫性甲状腺炎(EAT)大鼠血清自身抗体、降低甲状腺细胞Fas/FasL， Bax表达，增加甲状腺细胞Bcl-2表达。结论软坚消瘿汤可能通过降低EAT血清中自身抗体水平，抑制Fas/FasL、Bax表达，提高滤泡上皮细胞Bcl-2表达从而起到减轻甲状腺细胞凋亡的作用。
　　【关键词】 软坚消瘿汤; 实验性自身免疫性甲状腺炎; Fas/FasL; Bcl-2/Bax

　　细胞凋亡为细胞程序性死亡过程，在EAT中发挥重要作用。Fas/FasL凋亡蛋白促进凋亡发生，Bax、Bcl-2中前者促进凋亡，后者抑制凋亡。本实验旨在从凋亡蛋白角度揭示软坚消瘿汤治疗自身免疫性甲状腺炎机理。
　　1 材料与仪器
　　1.1 动物SPF级SD雌性大鼠，体质量(110±10)g， 4～6周龄，购于沈阳医学院实验动物中心。合格证号：SCXK(辽)2003-0016。
　　1.2 仪器

　　酶标仪(奥地利)型号：Anthos 2010;37℃电热恒温培养箱(上海博讯医疗设备公司)型号：HXP-9052MBE; 离心机(法国Jouan)型号：C4-12;微量移液器(美国热电);电子秤(上海精密仪器有限公司)型号：JY5022。
　　1.3 主要药品及试剂
　　1.3.1 造模药品及试剂盒甲状腺球蛋白(TG)、弗氏佐剂(美国SIGMA公司)，甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)等酶联免疫检测试剂盒(美国 ADL公司)，Fas抗体、FasL抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、免SP试剂盒、DAB试剂盒等免疫组化试剂盒(北京博奥森有限公司)。
　　1.3.2 观察药品雷公藤多苷片，江美通制药有限公司产品,购于辽宁中医药大学附属医院药局;软坚消瘿汤中药饮片购于辽宁中医药大学附属医院中草药局。
　　2 方法

　　2.1 动物模型建立及分组SPF级SD雌性大鼠60只，适应性喂养1周，按体质量层次随机取15只为正常对照组，剩余为造模组。第2周起造模组饮用高碘水浓度为500 g/L[1]，正常对照组予蒸馏水。第4周起造模组于双后足皮下多点注射由完全弗氏佐剂(CFA)充分乳化成油包水状的TG(TG∶CFA=1∶1)，共两次，中间间隔两天，每次每只含TG100 μg[2]，作为初次免疫，第5周于后背皮下多点注射由不完全弗氏佐剂(IFA)乳化的TG，每次每只含100 μg，每周1次，连续4周，作为加强免疫。第8周结束时成模。将成模后的大鼠随机分为模型对照组(13只)、西医治疗组(13只)、中药治疗组(14只)。
　　2.2 给药方法给药剂量按人和动物体表面积折算的等效剂量比值表,计算出大鼠等效灌胃剂量。软坚消瘿汤组每只大鼠灌胃量为10 ml·kg-1·d-1，生药含量2.03 g/ml。西药组予雷公藤多苷片，研磨，温开水配成悬浊液(2.37 g/ml)等量灌胃。模型组及正常对照组灌服等量蒸馏水。4组均每天给药1次，连续6周。
　　2.3 检测指标及方法

　　2.3.1 抗体及细胞因子各组实验大鼠于治疗后第42天腹主动脉取血并处死，离心1 500 r/min获取血清，采用ELISA检测TGAb, TPOAb。
　　2.3.2 凋亡蛋白大鼠处死，取双侧甲状腺，按试剂说明常规免疫组化制片，双盲显微镜观察凋亡蛋白Fas、FasL 、Bax、Bcl-2阳性表达位置，Mias99 病理图像分析系统,定标为μm，检测灰度值。
　　2.4 统计方法采用SPSS17·0统计软件,数据满足正态性和方差齐性，组间采用方差分析,所列数据采用 ±s表示。
　　3 结果

　　3.1 Fas、FasL、Bax、Bcl-2在甲状腺细胞表达Fas、FasL、Bax、Bcl-2阳性表达主要定位于细胞膜及胞浆,均呈棕黄色或棕褐色颗粒样分布。
　　正常组:无明显淋巴细胞浸润，未见浆细胞，滤泡上皮细胞低水平表达Fas及FasL、 Bax,阳性率及着色均低;高水平表达Bcl-2，阳性率及着色均高; 模型组：明显淋巴细胞及浆细胞浸润，浸润淋巴细胞附近的甲状腺滤泡上皮细胞的细胞膜及胞浆内高水平表达Fas及FasL 、Bax,阳性率与着色程度均高, 低水平表达Bcl-2，阳性率与着色程度均高;在远离淋巴细胞浸润的滤泡上皮细胞Fas及FasL 、Bax呈低表达，Bcl-2呈高表达;浸润淋巴细胞上Fas及FasL 、Bax呈极低表达，Bcl-2呈高表达;雷公藤组：较少淋巴细胞及浆细胞浸润，浸润淋巴细胞附近的甲状腺滤泡上皮细胞的细胞膜及胞质内明显表达Fas及FasL、Bax,其阳性率与着色程度较低; Bcl-2阳性率及着色较高。中药组：少量淋巴细胞滤泡上皮细胞浸润未见浆细胞浸润，滤泡上皮细胞膜及胞浆低表达Fas及FasL、Bax，阳性率及着色较低，Bcl-2高表达，阳性率及着色较高(400×)。见图1～4。
　　3.2 各组大鼠血清抗体±s比较见表1。表1 各组大鼠血清抗体比较(略)

　　表1说明模型组与治疗组比较TPOAb有明显差异(P<0.01);治疗组间比较有统计学差异(P<0.05)。说明两治疗组均可以明显降低TPOAb，但中药组优于雷公藤组。
　　模型组与治疗组比较TGAb有统计学差异，雷公藤(P<0.05),中药组(P<0.01);治疗组间比较有统计差异(P<0.05)。说明二者均降低TGAb，但中药组优于雷公藤组。
　　3.3 各组大鼠甲状腺组织Fas、FasL(±s)比较见表2。表2 各组大鼠甲状腺组织Fas及Fasl比较(略)

　　表2结果显示模型组与正常组比较Fas、FasL明显升高(P<0.01)

　　模型组与治疗组比较有明显差异(P<0.01);治疗组间比较有明显差异(P<0.01)。说明二者均降低Fas 但中药优于雷公藤。
　　模型组与治疗组比较有明显差异(P<0.01);治疗组间比较有明显差异(P<0.01)。说明二者均降低FasL但中药优于雷公藤。
　　3.4 各组大鼠甲状腺组织Bax，Bcl-2比较见表3。表3 各组大鼠甲状腺组织Bax，Bcl-2比较(略)

　　表3结果显示模型组与正常组比较Bax明显升高(P<0.01)，Bcl-2明显降低(P<0.01)。
　　模型组与治疗组比较有明显差异(P<0.01);治疗组间比较有明显差异(P<0.01)。说明二者均降低Bax表达，但中药优于雷公藤。
　　模型组与治疗组比较有明显差异(P<0.01);治疗组间比较有明显差异(P<0.01)。说明二者均升高Bcl-2表达，但中药优于雷公藤。
　　4 讨论

　　软坚消瘿汤为张兰教授运用中医药理论，总结前辈及自己多年治疗经验创立的治疗本病的中药复方。此方具疏肝行气解郁、活血软坚散结之功，临床疗效甚好，通过本实验探讨其治疗EAT机理如下。
　　4.1 Fas/FasL与EATFas为细胞表面一种跨膜蛋白，是一种死亡受体，遇到甲状腺滤泡细胞死亡配体FasL会激活靶细胞死亡程序发生细胞凋亡。携有Fas 基因突变Lpr 小鼠和FasL 基因突变Gld 小鼠由于Fas系统缺失凋亡信号减弱致使凋亡减弱[3]。实验中治疗组Fas、FasL灰度值，均较模型组降低，且甲状腺细胞呈现低表达，但软坚消瘿汤组优于雷公藤组。推测中药可能通过降低Fas/FasL表达起到抑制甲状腺细胞凋亡的作用。Fas,FasL于淋巴细胞浸润周围滤泡上皮细胞表达丰富远离浸润区表达较少，同时淋巴细胞自身表达微弱，成离心样分布。表明软坚消瘿汤通过降低淋巴细胞浸润，进而减少细胞因子生成，间接降低了Fas,FasL水平。
　　4.2 Bcl-2， Bax与EATBcl-2， Bax同属Bcl-2家族为功能相反的一对蛋白，前者抑制凋亡，Bcl-2 调控Caspase-3 表达及活化对附近的甲状腺细胞发挥细胞毒性T 淋巴细胞作用,使其凋亡[4]。后者促进凋亡，二者表达比例失衡致使凋亡增加。本实验中，滤泡上皮细胞灰度值及免疫组化图片治疗组与模型组比较，Bcl-2呈高表达，Bax低表达，表明治疗后抑制凋亡蛋白即保护性蛋白增加，促进凋亡蛋白下降。实验结果表明中药组在调节Bcl-2， Bax表达方面优于雷公藤组。
　　4.3 软坚消瘿汤治疗EAT机制探讨Fas系统与Bcl-2关系密切，Fas 系统诱导的细胞凋亡常与Bcl-2 的下调相偶联, Bcl-2 的过度表达则可部分地抑制Fas 系统诱导的凋亡[5] 。本实验中，治疗组较模型组甲状腺细胞Fas/FasL，Bax灰度值及免疫组化图片表达均低，Bcl-2升高，但中药组较雷公藤组作用明显。前期实验表明软坚消瘿汤可降低AIT大鼠血中IL-1,TNF-α等细胞因子水平，故推测中药治疗AIT的机理可能为通过减少甲状腺的淋巴细胞浸润，降低血液中细胞因子水平，间接改变了滤泡上皮细胞Fas/FasL，Bcl-2/Bax表达，而Bcl-2升高又进一步降低了Fas/FasL含量，进而减少甲状腺细胞凋亡，使甲状腺滤泡得以保存。
　　【参考文献】
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