MRM3模式在多肽药物生物分析中的应用解决方案

       随着制药企业对生物治疗药物的日益重视,在药物研究中使用LCMS定量分析蛋白和多肽药物已经引起越来越多研究者的兴趣。艾塞那肽是一种治疗性多肽,目前已被批准用于治疗I型和II型糖尿病。艾塞那肽可增强胰腺β细胞分泌葡萄糖依赖性胰岛素,以调节糖代谢和胰岛素分泌。 近年来,血浆中艾塞那肽的浓度测定主要通过配体实验来完成,例如利用酶标免疫测定法进行艾塞那肽的 药代动力学研究。但是,由于某些具有相似理化性质的化合物的存在,致使酶标免疫测定法缺乏足够的特异 性和选择性,导致采用该方法分析将面临一定的风险。基于以上原因,采用AB SCIEX QTRAP® 5500系统的 MRM3模式确保分析血浆中多肽药物时能够达到更高的选择性。 实验方法
       样品制备:提取人血浆中的艾塞那肽,用氮气吹干,复溶。在所有的操作步骤中,pH值及有机相都要严格控制。 串联质谱技术在药物高通量筛选和生物分析中的应用

       液相色谱条件:UHPLC采用Shimadzu UFLC LC-20ACXR;反相色谱柱为C-18 2.0 x30mm,5μ;流速为 0.6mL/min;进样体积为5 μL;流动相A为含0.1%甲酸的水溶液,流动相B为含0.1%甲酸的甲醇溶液;梯度5分 钟,流动相B浓度从2%升至95%。 质谱条件:使用AB SCIEX QTRAP® 5500系统中的MRM3扫描模式进行LC/MS分析。开启离子阱的动态填充时间(DFT)功能,在10,000Da/s的扫描速度下进行MS3扫描。总周期时间为0.17s。采用质荷比 838→396→202进行MRM3分析。QTRAP® 5500系统进行MRM3分析原理展示在图2中。 

       图1. 艾塞那肽结构。艾塞那肽是由39个氨基酸组成的多肽(MW =4186.6 Da),是糖代谢和胰岛素分泌的调节剂。 

       图2. MRM3定量分析工作原理。首先在Q1四极杆中选择母离子,然后在Q2碰撞池中碎裂,其子离子在线性离子阱中富集并分离,接着通过激发产生第二级碎片,然后将第二级产物离子扫描至检测器。 
       实验结果
       在增强全扫描模式(EMS)下,选择多电荷母离子[M+5H]5+838.3作为前体离子(母离子,图3,上左 图)。当前体离子碎裂后,选择m/z 396.4为级子离子(增强子离子扫描(EPI),图3,上右图)。 级子离子m/z 396.4在阱内进一步碎裂产生MS3质谱(图3,下图),选择其中主要的碎片离子m/z 202.2作为 MS3定量的第二级子离子。 艾塞那肽检测结果 使用MRM3方法后,显著提高了人血浆中艾塞那肽分析方法的选择性。图4展示出了MRM3方法与传统的 MRM定量方法所得结果的对比,MRM3方法结果中基线更低,完全消除了血浆中的内源性干扰。QTRAP® 5500 快速的扫描速度(10,000Da/s)可使分析物的色谱峰有足够的采集点,从而使定量结果具有很好的重现性。 如表1中所示,MRM3方法显著改善LLOQ及QC的分析结果,6次连续进样分析的准确度及CV%证明: MRM3方法具有很好的定量性能,完全适用于生物分析。
 

       图3. MRM3实验设计。 EMS扫描(上左图)后选择丰度高的母离子,然后使用EPI扫描以识别出强的碎片离子(上右图),后采用MS3扫描选择佳第二级碎片进行提取。 

       图4. MRM3检测方法显著提高血浆中化合物检测的选择性。 进行血浆中艾塞那肽检测时,MRM3模式可通过消除色谱干扰、降低背景噪音来改善LOQ。
结论
       更好的线性(R2=0.996)。 表1:MRM3方法检测的准确度和重现性。质量控制样品的重复性结果表明: MRM3分析与验证的生物分析相一致。 串联质谱技术在药物高通量筛选和生物分析中的应用

       图5. 使用MRM和MRM3方法检测人血浆中艾塞那肽的标准曲线。 MRM3(右图)的线性范围是5-1000ng/mL,相对MRM(左图)的250-1000ng/mL,MRM3方法明显具有更好的线性(R2=0.996)。 

       表1:MRM3方法检测的准确度和重现性。质量控制样品的重复性结果表明: MRM3分析与验证的生物分析相一致。 
       结论
       1. MRM3分析方法可以成功应用于人血浆中艾塞那肽生物分析。 
       2. MRM3分析能够提高生物分析方法的选择性,消除基线噪音及色谱干扰,与传统的艾塞那肽MRM分析结果相比体现了卓越的分析性能。 
       3. MRM3分析结果显示其可获得从5-2000ng/mL浓度范围内优异的标准线性。相比较,传统的MRM方法的 线性浓度范围为250-1000ng/mL。
       4. MRM3方法检测的准确度和重现性完全符合生物分析实验的要求。