乳腺癌中FoxP3表达与上皮间质转化的相关性

         FoxP3足叉头样转录因子家族的成员之一，早期发现其特异性表达于CD4+CD25+调节性T细胞，参与细胞发育和免疫抑制功能的发挥。近年来发现，乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞也有FoxP3的表达。有研究认为肿瘤细胞表达FoxP3能够促进肿瘤发生淋巴结转移和远处转移，是肿瘤预后不良的独立预测因素之。上皮间质转化( epitheli-al-mesenChymal transition．EMT)是具有极性的上皮细胞转化成为具有移行能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程，其在人胚胎干细胞分化过程中起着关键作用，在组织修复再生、器官纤维化和肿瘤发生时被罩新激活啦。目前普遍认为EMT是肿瘤细胞发生侵袭与转移的重要机制。 本研究采用免疫组织化学方法检测FoxP3蛋白和EMT标志物在人乳腺癌组织中的表达水平，探讨FoxP3和EMT之间是否存在相巧联系。

         1 材料与方法

         I.I材料
         I.I.I患者资料所有标本均取白天津医科大学肿瘤医院乳腺外科2003年5月至2005年7月手术切除的浸润性乳腺癌组织标本，共74例，经病理确诊均为非特殊型浸润性导管癌。患者均为女性，年龄分布27 - 69岁（中位年龄49岁）。手术前均未接受过抗癌治疗（包括放疗、化疗及内分泌治疗等）。术后分期：I期3例，ⅡA期26例，ⅡB期24例，ⅢA期8例，ⅢB期2例，ⅢC期10例，Ⅳ期1例。组织学分级：I级4例，Ⅱ级49例，Ⅲ级21例。ER(+)14例，PR(+)12例，Her-2( +)45例。

         1.1.2主要试剂鼠抗人FoxP3单克隆抗体(PCHIOI)购白美I习eBiosc:iem:e公司。兔抗人TGF-B l多克隆抗体购白北京中杉金桥生物技术有限公司。E-Cad-herin、N-Cadherin．Vimentin、Fibronec:tin鼠抗人单克隆抗体购白美困BD公司。EnVision两步法免疫组织化学检测试剂购白福州迈新生物技术有限公司。

         1.2方法
         1.2.1 免疫组化检测乳腺癌组织中FoxP3、TGF-B 1和EMT标志物的表达标本经10%中性甲醛同定，常规石蜡包埋，4¨m厚连续切片，常规HE染色及En-Vision法免疫组织化学染色。石蜡切片常规脱蜡水化，柠檬酸钠缓冲液热抗原修复，3%H202室温孵育20 min阻断内源性过氧化物酶活性。滴加一抗，40C孵育过夜。滴加酶标记的二抗，湿盒室温孵育30min。DAB娩色，苏水精对比染色。常规酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。以PBS代替一抗做阴性对照。 1.2.2阳性结果判断 1）FoxP3以乳腺癌细胞细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达，阳性细胞数≥25%为FoxP3表达阳性切片。2）TGF31以细胞质内现黄色或棕黄色颗粒为阳性着色。结果采用半定量计分方法，阳性细胞数按无着色、阳性细胞数≤20%、21% - 50%和>50%分另0判为0、1、2、3分，着色强度按无着色、黄色、棕黄色和棕褐色分别判为0、1、2、3分。两顼评分结果相乘>6视为强阳性表达。3)EMT标志物：①E-Caclherin以细胞膜…现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数>50%为阳性切片。②N-Cadherin以细胞膜和（或）细胞质内…现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数>1%为阳性切片。③Vimentin以细胞质内…现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数>1%为阳性切片。④Fibronec:tin以细胞膜f11现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数>1%为阳性切片。其中E-Cadherin为上皮细胞标志物，N-Cacl-herin、Vimentin和Fibronec:tin为间质细胞标志物。上皮细胞标志物表达阴性或者任一间质细胞标志物表达阳性计为EMT阳性(+)。

         1.3统计学方法

         数据采用PASW Statistic:s 18.0统计软件进行Mann-Whitnev U检验、Kruskal-Wallis检验和X2检验，用偏相关分析和-)L/ Logistic:同归分析进行相关性分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

         2结果
         2.1 FoxP3和TGF-(31的表达情况 　　

         FoxP3在乳腺癌细胞常见的表达部位为细胞质，其次为细胞质与细胞核均表达，少见的表达棋式是仅细胞核表达。考虑到FoxP3是转录因子，只有进入细胞核内才能发挥作用，所以将胞核阳性作为FoxP3表达阳性的评价标准。在所有检测的乳腺癌组织中，36.5%( 27/74)的病例FoxP3蛋白表达阳性。39.2%( 29/74)的病例高表达TGF-(31(图1)。

         2.2乳腺癌组织FoxP3的表达与患者临床病理特征的关系
         比较乳腺癌实质FoxP3蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、pTNM分期、ER、PR、Her-2的关系，发现FoxP3的表达与淋巴结转移有关(P<0.05)，与其他指标兀关（P>0.05，表1）。

         2.3 EMT标志物的表达情况
         E-Cadherin主要表达于细胞膜，部分亦表达于细胞质。其阻陛表达率为71.6%。N-Cadherin表达丁细胞膜和（或）细胞质，其阳性表达率为37.8%。Vimentin表达于细胞质，其阳性表达率为20.3%。Fibronec:tin表达于细胞膜，其阳性表达率为12.2%。根据EMT发生的判定标准，EMT阳性率为40.5%（图1）。

         2.4乳腺，高中FoxP3、TGF-[31和EMT发生的相关隋况 1)应用二元LogistiC同归务析向后步进法分析FoxP3和TGF-(31与EMT的关系。以EMT为因变量Y(未发生=0，发生=1)，以FoxP3和TGF-(31为白变量X，建立Logistic:同归模型：Logit (p) =-0.901+1.249×TGF-(31。Logistic:同归模型似然比检验结果差异有统计学意义(X2=6.481，df=l，P=O.OII)，同归系数Walcl X2检验硅示P=0.013。优势比OR=3.487( 1.308，9.297)，95%CI上下限均>1，因此可以认为TGF-(31的表达可以诱导EMT发生。2)在控制EMT的条件下进行FoxP3与TGF-(3 1的偏相关分析，发现两者之间存在相关性(P<O.OOI)。可据此认为在消除EMT影响的条件下，乳腺癌FoxP3与TGF-[31的表达间存在相关性。

         3讨论
         FoxP3是影响CD4+CD25+调节性T细胞发育的一个关键转录因子，并且能维持其免疫抑制功能，一直被认为是CD4+CD25+调芾性T细胞的特异性标志。之后研究发现FoxP3在部分CD4+CD25_rl'细胞和CD8+rl'细胞也有表达，而近年来研究证实FoxP3在多种人正常上皮细胞和肿瘤细胞亦有表达，影响肿瘤的发生发展以及肿瘤细胞与肿瘤微环境之问的相H作用。胰腺癌和黑色素瘤细胞异常表达FoxP3，在共培养条件下能够抑制初始CD4+CD25-T细胞的增殖，促进肿瘤细胞免疫逃逸。

         本研究结果屁示，在74例检测的乳腺癌组织中，36.5%的病例FoxP3蛋白表达附性，并且乳腺癌组织表达FoxP3与淋巴结转移相关(P<0.05)，提示FoxP3可能在肿瘤的进展和转移过程中发挥作用。Merlo等隋1发现乳腺癌表达FoxP3能够作为发生远处转移风险的预测因素。同时，本研究也发现FoxP3的表达与转化生长因子-13 l(Lransforming growLh facLor-131，rlJF_13 1)的表达以及EMT相关，提示其可能通过调节TGF-13 l而影响EMrl'，从而影响肿瘤的进展。 上皮细胞在EMrr过程中发生一系列生物学改变，如细胞极性消失、丧失细胞问连接、细胞游走或散在分布以及晕新表达问质细胞标志物等．从而转化为具有问质特点的问质样细胞阳。EMrr不仅存在丁胚胎发育和组织分化过程中，同时也参与组织修复、器官纤维化以及肿瘤的浸润转移阳1。EMrl'能够赋予细胞侵袭和转移能力、诱导干细胞特性、阻止自身 凋亡和衰老以及诱发免疫抑制等阳1，这些特性对于肿瘤的侵袭与转移至关重要，因此近年米EMT的诱发因素及其与肿瘤微环境之间的相互作用一直是研究热点。转化生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、基质金属蛋白酶等都可以诱导肿瘤细胞发生EMT，而其中研究时问久、机制阐释为透彻的就是TC.F-β1。在体外培养条件下外源添加TGF_βl能够诱导乳腺癌细胞系发生EMT，而近年来研究认为细胞白分泌TGF_β1在诱导细胞发生 EMT中发挥作用，同时也参与细胞经历EMT后的问质细胞样状态的维持陋。Zuo等b1报道乳腺癌细胞表达FoxP3。有文献报道用siRNA抑制黑色素瘤细胞表达FoxP3能够下调TGF-β1的表达；反之，过表达Foxl，能够调TGF_β1的表达。即肿瘤细胞叮以通过FoxP3卜调TGF-β1的表达，从而影响EMrl'作用进而促进肿瘤的进展和转移。 本实验发现乳腺癌细胞F'oxP3的表达和rl'GF_β l的高表达之问存在相关性，而且TC.F-β1与EMT发生相关(P<0.05)。推测乳腺癌细胞叮能通过FoxP3调节TCF-βl表达，而TCF-βl逦过白分泌的形式参与乳腺癌细胞EMrl'的发生与维持过程。
         近期研究表明，FoxP3町以控制多种与TGF-[3信号通路和EMT相关的基因表达，进一步支持了本文的结论。 虽然随着治疗方法的不断改进，乳腺癌的生存率得到了极大地提高，但是肿瘤转移仍然是威胁患者生存的重要原因。本结果显示FoxP3在乳腺癌转移中扮演再要角色，有町能是新的分子标志物，成为免疫治疗的新靶点。