环介导等温扩增技术研究进展及其在病原检测中的应用

　　环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是日本学者Notomi一于2000年建立的一种新型的核酸扩增技术。近年来该技术在不断的改进和完善过程中被广泛应用于各种病原检测，本研究就LAMP技术进展和病原检测应用这两方面研究进展进行综述如下。 　　

1LAMP技术的进展
　　1.1检测反应的加速提高检测反应的速度，缩短病原检测用时对于疾病的快速诊断和对症治疗具有重要意义。 　　

Nagamin。等发现在LAMP反应体系中增加2条与扩增产物茎环结构互补的环引物能够有效地提高扩增反应速度，显著缩短检测反应时间。Tanner等「31在多重LAMP技术的研究中使用Bst2.0DNA聚合酶替代传统的BstDNA聚合酶，实验结果显示能够缩短约50%的检测时间。新一代聚合酶是通过对BstDNA聚合酶进行大量计算模拟优化之后推出的，具有酶促反应更快，产量更高，对缓冲体系耐受能力更广，热稳定性更好的优点。这些研究和应用增强了LAMP技术在疾病快速检测的应用潜力。 　　

　　1.2L检测反应结果判读的可视化早期的LAMP实验结果的判读方法与PCR相同，均为对产物进行琼脂糖凝胶电泳、嗅化乙吮染色进行判断。Mori等〔发现LAMP反应在合成DNA的同时伴有副产物焦磷酸根离子生成并与反应缓冲液中的Mgz+离子结合生成不溶于水的焦磷酸镁，反应后对产物进行离心能够使沉淀更为明显可见，便于肉眼判读实验结果;对焦磷酸镁的产量和反应合成DNA的产量之间的关系进行研究，结果显示二者的产量呈线性相关。Iwamoto等[s〕在反应完成后加人SYBRGreenI荧光染料，能与双链DNA分子结合，通过观察扩增产物溶液是否从橘黄变为绿色来判断实验结果。荧光染料显色方法灵敏度高，但反应结束后添加染料的操作容易造成产物气溶胶扩散，引起后续相关实验出现假阳性。Boehme等在配制反应体系时加人指示剂钙黄绿素，扩增反应产生的焦磷酸根离子与金属离子结合降低了缓冲液的金属离子浓度使得钙黄绿素转变为游离状态，在紫外光照射下发出绿色荧光。反应结束后只需紫外灯照射便可读取实验结果，避免实验室环境污染。Tomit。等〔}l对钙黄绿素显色法进行了改进，在反应体系添加MnCh使得钙黄绿素显色反应在可见光下也可以观察，通过肉眼观察扩增产物溶液是否从浅黄色变为绿色来判断实验结果。Goto等「8〕引入了另一种金属离子指示剂经基蔡酚蓝，通过对Mgz+离子浓度变化进行监测:反应中焦磷酸镁沉淀造成了Mgz十离子浓度降低，经基蔡酚蓝指示剂发生相应的颜色变化，反应结束后以在可见光下观察溶液是否由紫色变为天蓝色作为结果判断的依据。钙黄绿素和经基蔡酚蓝显色法的应用，优点在于检测结果可以在可见光下观察反应前后溶液颜色变化来判读实验结果，不会造成实验室污染并降低了仪器需求，使之更适于现场以及仪器配置不足的城镇级别医院、疾控中心进行病原检测工作。 　　

　　1.3检测反应的高通量化近年来以多重PCR、基因芯片、液相芯片技术为代表高通量检测逐渐成为病原检测筛查的热点，LAMP反应只能检测一种病原的局限也得到改进。早期的多重LAMP检测方法是在引物中增加限制性内切酶位点，通过对扩增产物酶切、电泳鉴定酶切产物条带大小及数量来判断扩增结果，但处理步骤耗时费力，未能推广。Li等一9开发了组合LAMP方法是将各种反应单元进行组合以提高检测通量，可以同时检测6种虫媒病毒，但没有合并减少反应数量，不能降低检测成本。Liang等「io〕在基于分子条码和焦磷酸测序技术基础建立了多重LAMP检测方法，在内引物F1P引人的分子条码能被内切酶识别并产生缺口，缺口在焦磷酸测序反应中被修补并释放信号，达到多重检测的目的。由于焦磷酸测序法只能产生A'CCG对应的4种荧光信号，所以这个方法大检测通量为4重。Tanner等[37通过引人荧光探针建立了多重LAMP检测方法，用荧光淬灭基团修饰内引物FIP，反应前先通过变性一退火使得荧光探针与引物FIP结合，此时荧光信号被屏蔽;将FIP一荧光探针二聚体用于LAMP反应，荧光探针在反应中被Bst聚合酶置换下来成为游离状态，在激发光照射下释放荧光实现了多重检测，反应能检测的病原数量由具体使用实时荧光定量PCR仪的荧光通道数量决定，一般为4重以上，但这个方法也增加了对仪器的依赖性。 　　

　　1.4检测样品处理方法的简化标本的核酸提取是核酸类检测方法的前提工作，需要相应的人力物力和时间。简化样品处理的操作步骤既能降低检测成本，缩短检测用时，对提高应对突发急性传染的快速诊断能力具有现实意义。 　　

　　Kanek。等{川在研究单纯疙疹病毒和水痘一带状疤疹病毒检测时进行了样品直接检测研究，60份临床标本中提取病毒DNA后进行LAMP方法和PCR方法检测，检出率分别为41/60和37/60;临床标本不提取核酸，直接进行LAMP方法和PCR方法检测，检出率分别为26/60和1/60。实验结果提示PCR方法更容易受到样品中复杂成分影响，LAMP方法宽容度更好，耐受性更强，检测结果更为稳定，说明简化样品处理方法对于LAMP技术具有实用价值。早期实验中使用免疫捕获技术、直接包被结合方法等样品吸附方法替代了核酸提取，但由于吸附流程耗时，未能推广。Yamamur。等〔iz〕使用了DNA滤纸对全血进行吸附，洗除杂质后将滤纸作为LAMP检测的模板，这个方法缩短样品处理时间、简化操作，还能使不具备检测能力的卫生机构能将临床标本进行简易处理后送至上级检测实验室，有效提高工作效率。Curb。等[‘3在检测HIV时进行了对血浆和血液标本灭活后直接检测的研究，处理方案经过优化调整，对血浆标本进行1:3稀释后1000C灭活5min，对血液标本进行1:5稀释后1170C灭活5min，然后进行RT-LAMP反应进行检测，能直接、有效检出HIV,整个检测用时缩短为90minxNie等’使用热裂解方法对咽拭子样品的处理，处理方案为标本与反应体系95℃加热30s，冰浴冷却后加人聚合酶、染料，可直接检测人手足口病主要病原人肠道病毒71型。 　　

　　1.5引物设计引物组的设计和验证是LAMP技术起始工作的重点。引物组由2条外引物、2条内引物和2条环引物组成，其中每条内引物针对2个区域，这6条引物针对了靶基因的8个区域，在提高引物特异性的同时也给引物设计增加了难度。目前研究人员广泛使用的引物设计软件主要是基于JAVA的在线设计软件PrimerExplorerV4，该免费软件存在不能同步设计环引物、序列长度不能超出2000帅、需要单独安装JAVA控件、只能使用浏览器在线设计等局限，而且软件不具备引物特异性检验的功能，设计完成后仍需要手工进行Blast比对验证来排除误判。Tome、等[”〕开发的基于Perl语言开源程序LAVA既可以同步设计环引物，还可以就多序列比对进行分析和引物设计;但是LAVA只能在Unix/Linu、界面下运行，在使用中也受到一定的限制。查磊等”fi]
　　

　　采用Delphi语言开发了BiosunLAMP软件，在设计LAMP引物组的同时能进行引物特异性检验，还能够针对多序列比对信息进行通用型和特异型引物的设计。商业化的LAMPDesigner软件具有LAMP引物设计、引物Blast验证特异性、引物组错配验证等功能，还具有较好的数据库管理能力，但因为软件价格高昂并没有在研究人员中得到普及推广。 　　

2LAMP技术在病原检测中的应用 　　

　　2.1呼吸道病原检测进人21世纪以来，SARS、禽流感等呼吸道传播疾病对人类健康、社会稳定造成严重威胁。对这些突发传染病病原的快速检测对于疾病预防控制，维护社会稳定具有重要现实意义。Hong等[n〕建立针对SARS-CoV的LAMP检测方法只需要63℃反应1h，与传统RT-PCR方法相比较，检测反应的灵敏度提高了100倍，检测限达到0.O1PFU。李启明等〔LB」设计了高致病禽流感HSNI的HA,NA引物，检测灵敏度达到100拷贝，与其他亚型流感病毒无交叉反应，而且NA引物组与H1N1型流感病毒反应呈阴性，显示引物组具有的高特异性。在2009年全球HINI流感大流行暴发后建立了针对人甲型H1N1流感病毒HA基因的RT-LAMP检测方法，可在1h内获得结果，检测限为60拷贝，与其他型别流感病毒无交叉反应，并通过加人经基茶酚蓝指示剂增强了检测反应结果判读的可视化。Nie等f2G〕在2013年H7N9禽流感暴发后建立了针对该病毒HA和NA基因的RT-LAMP检测方法，该方法与H1N1,H3N2,HSNI等流感病毒均无交叉反应，在5份H7N9患者临床标本的检测中与国家流感中心双重RealtimeRT-PCR一致。 　　

　　2.2胃肠道病原检测近年来手足口病和感染性腹泻病一直高居丙类法定传染病报告发病数前三位，对人类健康尤其儿童生命安全造成严重危害二Ni。等川对手足口病主要病原，人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的VP1基因设计引物，R'I'-LAMP检测反应经过柯萨奇病毒A组、B组和埃可病毒组等多种肠道病毒验证无交叉反应，检测的灵敏度分别为0.33TCIDS。和1.58TCIDSG，与RealtimeRT-PCR灵敏度相当。Jiang等‘”〕建立的HEV71病毒检测方法，RT-LAMP检测反应与其他型别肠道病毒无交叉，检测灵敏度达到0.O1PFU,40份临床标本检测结果显示该方法灵敏度和特异性分别为92.9%和。 　　
　　2.3虫媒病毒检测虫媒病毒是以节肢动物为媒介在脊椎动物中传播的病毒，病毒种类多样，能引起乙型脑炎、登革热等多种疾病。Parida等〔z3〕对登革病毒1-4型分别设计了以病毒3‘非编码区为检测对象的引物，建立了登革病毒型特异性的RT-LAMP检测反应。实验显示能区分登革病毒的4种血清型，与乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒等无交叉反应;与病毒分离方法比较，灵敏度和特异性分别为和93%oToriniw。等〔zap以乙型脑炎病毒E蛋白基因为靶基因建立了RT-LAMP检测方法的灵敏度为1PFU，与传统RT-PCR方法相当，并与登革病毒、西尼罗病毒无交叉反应。 　　

L1等I9]通过组合RT-LAMP反应同时检测登革1-4型病毒、乙型脑炎病毒和西尼罗病毒，通过168份临床标本和279份蚊虫标本的检测，该检测方法特异性达到了，灵敏度高于传统RT-PCR方法100倍。 　　

　　2.4其他重大传染病病原检测艾滋病、肝炎、肿瘤等是关系到整个社会公共健康、社会秩序稳定的重大公共卫生问题，针对这些疾病的检测技术研究和应用具有重要的社会意义。Curti。等〔”〕针对艾滋病病原HIV病毒1型的蛋白酶基因及P24蛋白基因区域设计引物，RT-LAMP检测实验室构建的HIV-1的DNA和RNA的灵敏度分别为100和10拷贝DNA分子，1000和100拷贝RNA分子。Cai等[25〕使用建立了检测乙型肝炎病毒的实时荧光定量RT-LAMP方法，经实验验证该方法95%置信区间下检测限为210拷贝/ml，能达到8个数量级的线性范围。Yang等[26〕针对丙型肝炎病毒的5’非编码区设计引物，并引人加速引物(acceleratingprimer,AP)，建立检测HCV的AP-LAMP检测方法，该方法的检测限为84IU/mloIwat。等[z}〕建立了检测鼻咽癌病原EB病毒的LAMP检测方法，在108份疑似患者临床标本的检测中以血清学诊断方法为金标准，平行使用LAMP和RealtimePCR方法进行检测，结果显示LAMP方法检测的灵敏度和特异性分别是86.4%和,RealtimePCR方法的分别是84.1%和98.4%,LAMP方法略优于RealtimePCR方法。 　　

　　3参考文献 　　

　　Notomi T,Okayama H,Masubuchi H. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].{H}Nucleic Acids Research,2000.E63.
　　Nagamine K,Hase T,Notomi T. Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers[J].{H}MOLECULAR AND CELLULAR PROBES,2002.223-229.
　　Tanner NA,Zhang Y,Evans TJ. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification[J].{H}BIOTECHNIQUES,2012.81-89.
　　Mori Y,Nagamine K,Tomita N. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J].{H}Biochemical and Biophysical Research Communications,2001.150-154.
　　Iwamoto T,Sonobe T,Hayashi K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex,M.avium,and M.intracellulare in sputum samples[J].{H}Journal of Clinical Microbiology,2003.2616-:2622.
　　Boehme CC,Nabeta P,Henostroza G. Operational feasibility of using loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of pulmonary tuberculosis in microscopy centers of developing countries[J].{H}Journal of Clinical Microbiology,2007.1936-1940.
　　Tomita N,Mori Y,Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products[J].{H}Nature Protocols,2008.877-882.
　　Goto M,Honda E,Ogura A. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue[J].{H}BIOTECHNIQUES,2009,(3):167-172.doi:10.2144/000113072.