微小RNA-143抑制人肾癌细胞株A498增殖及其对凋亡的影响

　　近期研究结果显示,一类具有调控功能的内源性非编码RNA,其大小长20一25个核昔酸,简称微小RNA(miRNA),miRNA通过与其靶mRNA的端非翻译区结合实现靶mRN;}降解或翻译抑制的作用,从而实现转录后水平基因表达调控的作用,广泛参与多种生物学进程如增殖、分化、凋亡等厂’目前关于miR-143在肾癌中的表达及作用的研究报道尚少_我们通过化学合成miR-143模拟物,观察其对肾癌细胞株X498增殖及凋亡的影响.
　　材料与方法 　　
　　1.材料:人肾癌细胞株A498购自中国科学院细胞生物学研究所,Opti-MEMI转染用无血清培养基购自Cil>c<,公司,miR-143mimic及转染指示剂购自广州锐博科技有限公司,Lipofectamine 2000(简称Lipo2000)购白美国Invitrogen公司,细胞计数试剂盒(CCK-8)试剂盒、胎牛血清(FBS),RPMI1640培养基购自碧云天生物公司,膜联蛋白`l一异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物公司.
　　2.细胞培养及转染:A498细胞株采用含10%FBS,100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI164.培养液在37}C,501cCOZ条件下培养实验时取对数生长期细胞,转染前241;将细胞1:2传代于6孔板中,以不含抗生素的培养基培养细胞生长至80}}e-90%左右时进行转染.按照Lipofectamine2000使用说明转染miR-143mimics及对照序列,实验分为3组:miR-143mimics转染组、阴性对照转染组(I\C组)、空白对照组(Opti-MEMI无血清培养基培养的A498细胞)miR-143mimics和转染对照序列用量为60nmol/L;同时转染F.}M标记的阴性对照为60nmol.}L转染24h后荧光显微镜(Olympus公司)下观察并评估转染效率,进行后续实验.
　　3.CCK-8检测细胞增殖活性:细胞转染6h居,}6孔板消化,洗涤、离心、混匀后计数2x10个接种于96孔板中,每组细胞设6个复孔,另设6孔空白对照用于去除背景,继续培养至24,48,72,96h,每孔加入IO闪CCK-8试剂,继续孵育1h,酶标仪(Labsvstem公司)测定490nm处各孔吸光度(Aa9o)值,扣除背景后,作出细胞增殖曲线,实验重复3次4..}nnexin`'-FITC细胞凋亡检测:取对数生长期细胞,按方法2中分组进行转染,每组设3个复孔,转染48h后,消化收集细胞并用400目滤网过滤,制备浓度1x100/L单细胞悬液.磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,用200闪1x结合缓冲液将细胞重悬,取100},1细胞重悬液加入5N.,1Annexin}-FITC和5}l碘化丙锭(PI标记,避光室温反应15min,再加人400}.ilx结合缓冲液,Ih内上流式细胞仪分析细胞凋L_率,结果取平均值.
　　

　　5.统计学方法:应用SPSS17.0统计软件分析,数据用均数士标准差(x1.s)表示,采用Student'st检验和方差分析,两两比较采用LSD法结果1.细胞转染效率检测:X498细胞转染F_}11转染指示剂对照序列24h后,荧光显微镜下观察荧光分布,可见80%以上的细胞内有荧光分布,转染效率达80%以上2.CCK-8检测细胞增殖:从图1结果叮见,转染后24,48,72,96h与空白对照组比较,>yC组细胞增长未见抑制,而,niR-143mimics转染组细胞增殖则明显抑制,抑制效应在转染48h后显现,并持续48h以上(P<0.O5).
　　3.流式细胞仪检测转染miR-143mimics后A498凋亡结果:miR-143mimics转染组细胞凋亡率为(9.10士2.31)%,显著高于NC组〔(4.23士1.52>%.与空白讨照组}13.4311.61)%,组间差异有统计学意义{P<0.O5).
　　讨论
　　目前已发现多种miR1}A与肿瘤关系密切,如miR-155,miR-200c,miRNA-518h等[?-3,部分小分子RNA可作为肿瘤诊断和预后的标志分子例如let-7,miR-16等,对确定治疗方案有重要作用"1TI1R}'A可能通过调控多种分子通路参与肾癌的发生,如细胞增殖、凋亡逃逸、血管生成等?J.本研究通过化学合成miR-143mimics,并将其转染至人肾癌细抱株A498中,检测其对肾癌细胞增殖及凋亡的影咽,发现其具有抑制细胞增殖、诱导肾癌细胞凋亡的作用一提示小分子miR-143可能为肾癌的潜在治疗靶点,其具体的分子机制尚有待进一步研究.
　　参考文献 　　
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