儿童原发性限制型心肌病三例的临床特征及遗传分析

         限制型心Hl1病(RCM)是以b室充盈受限和舒张功能障碍为特征的一类`b肌病,主要表现为心室舒张未升高和b房扩大,而心室大小、室壁厚度和心室收缩功能大致正常与扩张型`b肌病(DCM)和肥厚型`b肌病(HCM)相比,RCM发病率较低,在儿童`b肌病中仅占3%~5%,但其预后较差,确诊后平均生存周期仅为2年"由于原发性RCM发病率低,相关研究不多.发病机制H前仍不清楚,原发性RCM患者巾30%呈家族性,提示遗传因素是其亘要病冈:自2003年第l次报道在RCM患者中发现TNNI3基冈突变3以来,已发现了8个肌节蛋白基闪突变与RCM有关3^,以TNN"、TNNI3、M、H7、ACTC皋丨村突变为主,提示肌节蛋白基因突变是原发性RCM的重要遗传基础.冈此,在排除了炎症浸润、糖原代谢病、弹力纤维增生症、淀粉样变性等继发性疾病后,对原发性RCM患者开展肌节蛋白基冈突变筛查,对揭示RCM的发病机制具有重要意义Ⅱ本研究对确诊的3例原发性儿童RCM的临床特征进行总结分析,并进行肌节蛋白基因突变筛查,以期发现RCM发病的分子基础.
         资料与方法 
         1研究对象:共收集了3例RCM先证者及其家族成员资料,其中病例1和病例2来自加拿大医院心脏中心,病例3来自南京医科大学附属南京儿童医院心脏科c先证者均接受心电图、超声`b动图、心脏核磁共振成像(MRI)和(或)心导管及各项实验室检查,排除染色体异常、骨骼系统、糖原累积症、弹力纤维增生症及淀粉样变性等疾病.所有患儿的父母及同胞均经超声b电图、心电图等排除心脏疾病:RCM超声诊断标准"°:左、右心房增大,心室壁正常或轻度肥厚,心室内径正常;左b室舒张功能障碍,收缩功能正常;多普勒提示左`b室限制型mL流频谱:脉冲多普勒测量二尖瓣口lll流频谱E峰及A峰的峰值速度E/A比值≥2,E峰斜率时问(DT)缩短(≤150ms),左`b室等容舒张期缩短(≤70ms)另选择于我院门诊体检的10O名健康儿童为正常对照,其中男、女各50名.
         本研究获得患儿所在医院道德伦理委员会批准,所有研究对象或监护人均获知情同意i2.患儿`b肌组织病理检查:经知情同意,分别对病例l和病例2行经`b导管心内膜心肌活检c采用标准实验方法.对活检心肌组织分别进行常规组织学染色干Π投射电镜检查「3肌节蛋白基冈突变筛查:采集研究对象外周雨L提取基囚组DNA使用phme3软件对TNNT2、TNNB、ACTC、MYH7基冈所有编码序列及内含子一外显子拼接部位设计引物.聚合酶链式反应(PCR)扩增RCM患儿目的基冈片段并纯化,直接双向测序,通过对照基囚测序图谱、DHPLC检测结果以及与GenBank序列比对确定突变位点,使用Muhahn在线软件对比分析突变氨基酸的保守性.如发现突变,进一步检测该突变在家族成员及正常对照儿童的分布情况:
         结果
         1.患儿临床特征分析结果:病例1,为一名12岁女孩,患儿出生后即囚心脏杂音就诊发现膜部室间隔缺损(缺损大小约2mm),随访18个月除发现室间隔缺损持续存在、左心室稍大外,新发现左、右心房增大,肺静脉内异常反流,左心室收缩功能正常而舒张功能障碍.患儿于3岁时接受`b导管检查显示左`b室舒张期压力达16mmHg(lmmHg=0133kPa),右`b室压力达左心室压力的50%.心脏MRI进一步排除`b包异常及心肌肥厚.经心内膜心肌活检及其他各项检查后,患儿被诊断为原发性RCM合并室间隔缺损.患儿于8岁时渐出现劳力性呼吸困难,心电图提示P波增高增宽,下壁导联ST段下移;超声心电图显示左心房进一步增大,呈限制型血流频谱,左心室舒张功能严重受损(图1a).再次心导管检查发现左心室舒张期压力升高至"23mmHg.后患儿服用阿替洛尔,但症状仍进行性加重,目前纽约心功能分级(NYHA分级)Ⅲ级,等待心脏移植.病例2,女孩,既往体健,11岁时因劳力性呼吸困难就诊,心电图显示窦性心律,左心房增大,心室肥厚,广泛的T波改变.超声心动图示左心房显著增大,左心室舒张期内径和收缩功能正常,室间隔轻度肥厚,无心室局部反向运动,无左心室流出道梗阻,左心室舒张功能严重受损,呈典型的限制型血流频谱——左心房血流充盈速麂减低(0.笏m/s,正常>0.5m/s),DT缩短(1"ms,正常>150ms),E/A比值升高(E/A=2.32,正常<2),ⅣRT明显缩短(25ms,正常)TOms).心脏MRI进一步证实左心房显著增大,心室内径正常,室间隔中下段轻度肥厚(约为15mm),并排除心包疾病.
         改良Bmce运动试验中出现胸痛和广泛显著的sT段下移.心导管检查提示患儿心脏指数正常,左、右心室舒张期压力显著升高.经心内膜心肌活检等各项检测,排除相关继发因素后,患者被诊断为原发性RCM合并室间隔中下段轻度肥厚.患儿接受了口服美托洛尔(2mg·kg·d)和阿司匹林(80mg,每日3次)治疗,但病情仍进行性加重,气促明显并频繁胸痛(NYHA分级Ⅲ级).患儿终于首诊后15个月接受了心脏移植,目前已随访4年,一般情况良好.
         病例3,为一名I1岁女孩,既往体健.患儿10岁时因活动后气促、胸闷就诊,超声心动图发现左、右心房明显增大,心室内径及室壁厚度正常,左心室收缩功能正常,左心室舒张功能下降;彩色多普勒示限制型血流频谱.心脏MRI进一步证实上述改变,并排除心包异常.心电图显示窦性心律,双心房增大,广泛的T波改变.患儿气促渐加重,出现全身水肿,后予地高辛、卡托普利及利尿剂等口服,水肿好转,目前已随访1年余,仍活动受限,YHA分级Ⅱ级.2,患儿组织学检查结果:组织学检查提示病例1存在广泛的心肌细胞排列紊乱和纤维化,电镜显示肌节数量减少,线粒体显著增大变形(图2).病例2`心肌细胞轻度肥厚和间质纤维化,进一步透射电镜检查显示Z线排列紊乱,间距不规贝刂(图3).
         3.遗传学检测结果:对病例1检测发现了TNNI3基因第8外显子α611G>A杂合突变造成第204位精氨酸突变为组氨酸("04H),该突变在HCM及RCM患者中均被报道过(图1b).在病例2中发现了TNN"基因第9外显子⒍"7-302AATGAG杂合缺失突变,造成第100、101号氨基酸缺J走(p.Asn100~αu101del,100~101delNE),该突变目前尚未被报道(图4a).在病例3中发现了TNNI3基因第8外显子⒍575G>A杂合突变造成第192位精氨酸突变为组氨酸(R192H),该突变在RCM和HCM患者中均被报道过(图1b).蛋白序列比对发现,所有突变所处氨基酸在多个物种高度保守(图lb、图4b).所有突变只在病例本人中出现,而在其父母及正常对照儿童中均未检测到.除上述突变外,未发现与疾病相关的其他候选基因突变.
         讨论
         心肌肌节蛋白基因突变是HCM和DCM发病的重要遗传基础,目前至少已发现13个致病基因,与DCM有关的突变位点约20多个;而与HCM有关的突变位点达200多个["45],其中超过SO%集中在MYBPC3、MYH7、TNNI3、TNNI,、TPM1基因.由于RCM发病率低,且多为散发,目前研究报道不多.自2003年Mogensen等[3]通过对家族性RCM连锁分析发现TNNI3基因突变以来,已发现了8个肌节蛋白基因3化图维突变,主要分布在TNN"、TNNI3、MYH7、ACTC等基因.
        

         原发性RCM诊断较为困难,需排除限制型心包炎、瓣膜疾病、心肌炎症浸润、糖原代谢病、弹力纤维增生症、淀粉样变性等各种继发性疾病.与DCM和HCM相比,原发性RCM发病率低,但进展快、预后差,尤其是儿童RCM.Peddy等[7]报道1例12个月女婴RCM,发病后迅速进展出现严重心力衰竭,先后接受体外膜肺(ECMo)、双心室辅助装置(ⅤAD)治疗,并终于起病半年后接受心脏移植,遗传学检测发现了TNNI3基因突变.与既往报道相似,本研究报道的3例儿童RCM患者,均以气促、体力活动受限起病,进行性加重,迅速出现心力衰竭.对RCM患者遗传分析的报道提示肌节蛋白基因突变所致RCM进展快、预后差.既往在对不同种族心肌病患者的研究中,均发现了肌节蛋白基因突变.本文病例3是汉族女童,存在TNNI3基因R1叼H突变,其临床特征与国外报道一致.
         原发性心肌病具有临床表型和遗传异质性的特点,部分患者心肌病的临床表型存在重叠性,不同类型的心肌病可能由同一基因不同功能区域突变引起,而同一突变可引起不同类型心肌病["∶.由于RCM和HCM具有一些共同的临床特征,如均表现为心室舒张功能障碍,心肌收缩力正常或增强,且少数患者可同时出现RCM和HCM特征,提示二者可能具有共同的遗传基础.如TNNI3基因R204H突变在HCM和RCM中均被报道过[16].Rai等"]报道一RCM家系,其中部分RCM患者合并HCM,遗传检测发现了TNNI3基因R192H突变.本文中病例2同时合并室间隔中下段心肌肥厚,心肌活检显示存在轻度心肌肥厚,基因检测发现TNN"基因突变.因此,正如2006年美国心脏病协会(AHA)和2008年欧洲心脏病学学会(E℃)心肌病新的分类所强调的,我们应重视遗传因素在心肌病分类中的作用.
         对病例1和病例3的遗传分析分别发现了TNNI3基因"04H、R1呢H笑变,突变所在序列在多个物种高度保守.Neumayer等[I:]在1998年报道了一些小型膜部室间隔缺损患者成年后发展为RCM,后有研究发现肌节蛋白基因突变除导致心肌病外,还可引起先天性心脏病[I990].本研究中病例1合并室间隔缺损,再次提示心肌病变和先天性心脏结构异常可以存在共同的遗传基础.这是目前为止较早报道TNNI3基因突变与先天性心脏病相关的研究.Rz04H突变早发现于HCM患者,2000年报道发现于一例接受心脏移植的年轻RCM女性患者[16];2003年报道于1名19岁的男性RCM患者发现R192H突变[3],后又有研究在RCM合并HCM家系中发现了该突变[17].Rz04H和R192H突变预后均较差,病情进展迅速.
         肌钙蛋白复合体是心肌收缩、舒张活动中重要的功能成分,由肌钙蛋白T与肌钙蛋白C、肌钙蛋白I共同组成,其中肌钙蛋白C与Ca2+结合,肌钙蛋白I可以抑制肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用,而肌钙蛋白T可以将肌钙蛋白复合体与原肌球蛋白(Tm)和肌动蛋白相连,共同形成铰链样结构,对Ca2+的调节及肌肉的收缩起重要作用.研究发现,肌钙蛋白基因突变主要通过影响心肌纤维对C'+的敏感性、损害心肌舒缩功能而造成心肌病变,如对%2+的敏感性增加可导致HCM和RCM,对Ca2+的敏感性减低则可导致DCM[21].
         TNNI3基因R192H突变位于肌动蛋白与肌钙蛋白I结合区域,该突变引起心肌纤维对C'+的敏感度增加,造成心肌收缩力增强和纤维舒张功能受损[21],R1呢H转基因小鼠同样呈RCM表型[22].
         在病例2中发现了TNN"基因新发双缺失突变,该突变位于肌钙蛋白T与原肌球蛋白结合功能区,所在序列在多个物种高度保守.肌钙蛋白T在结构上分为3个功能区域——N端的选择性剪切区、T1结构域(第20~170号氨基酸,原肌球蛋白结合区)、"结构域(位于C端,第180~288号氨基酸).2006年Peddy等[7]报道在1例RCM患儿中发现了TNN"基因p%浼lE突变,随后20Og年Kash等[4]报道在RCM患儿中发现E136K突变.p%delE和E136Κ突变均位于肌钙蛋白T与原肌球蛋白结合的关键区域.
         Rnto等[23]研究发现TNN"基因突变导致心肌细胞Ca2+的敏感度增加和肌动球蛋白ATP酶活性下降,造成心肌收缩力增强和纤维舒张功能受损.有趣的是,对ρAsn100~αu101del突变功能研究显示第100号氨基酸Asn单个缺失造成心肌细胞C'+的敏感度增加,心肌收缩力增强和纤维舒张功能受损,第101号氨基酸Glu单个缺失造成心肌细胞C'+的敏感度降低,而         pAsn100_Glu101浼l双缺失整体效应表现为心肌细胞Ca2+的敏感度增加,心肌收缩力增强和舒张功能受损[z].TNN"不同位置的氨基酸突变产生不同的生物学效应,确切分子机制仍然不清楚,可能与突变导致心肌细胞C'+的敏感度及收缩功能改变、肌动球蛋白ATP酶活性改变等机制有关.
         总之,我们报道的3例儿童原发性RCM均病情迅速进展,遗传分析均发现了相关致病突变,显示了较高的突变阳性率,进一步证实心肌肌节蛋白基因突变是儿童原发性心肌病的重要病因.对儿童原发性RCM进行肌节蛋白基因,尤其是TNNI3和TNN"基因突变检测,对RCM的遗传诊断有重要意义.
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