耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌耐药机制与检测

           [关键词] 碳青霉烯酶；肺炎克雷伯杆菌； 耐药
          自二十世纪末，耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯杆菌 ( CRKP)被分离出来以后’1。，CRKP菌株所导致的感染在细菌感染疾病中的比重日渐增加=超广谱B一内酰胺酶（ ESBL） 基因使肺炎克雷伯杆菌（KP1菌株获得了能够灵活地水解包括头孢三代、单环类抗生素在内的B-内酰胺类抗生素的能力．由此碳青霉烯类抗菌素成对付难以控制的kp的有力武器：这种局面持续到3000年．CRkP的出现和广泛传播给临床医生 带来了巨大挑战一：2010年 离出被誉为‘超级酶“的新德里金属β内酰胺酶-l、D、f-1 1．使日益严峻的抗感染现状雪上加霜。：CRKP耐药菌抹已经成为临床严重感染和治疗失败的主要原因之一：为了有计划、有目 地地合理使用抗菌药物、延长现有药物的使用寿命、减少耐药发生和制定应对策略，我们对CRKP的耐药流行现状、耐药机制与检测手段作一综述： 
          一、LRKP菌株流行病学现状发现CRKP菌株是1996年在美国卡罗莱纳州北部，在美国以外分离出的CRKP菌株则是来自于法国一位曾在纽约有过住院史的患者[41。此后，CRKP在欧洲、中东、南美 和亚洲得以广泛流行和传播。在过去的10年里，CRKP检出数量在世界范围内出现难以置信的升高。1组来自美国CDC关 于医疗保健相关性感染的数据显示，CRKP从2000年的<1%迅速攀升到2009年的8c7e5。：EARS-\et数据库提示.2010年 欧洲CRKP从0.2%上升至59. St7e．在一些南欧国家甚至更高。中国大陆一项多中心研究收集了北京、安徽、福建等6个地区下呼吸道感染耐药KP．CRKP的检出率为3%，耐药菌侏呈现分布广、抗药性强的特点7二目前为止，CRKP已经在世界 范围内引起了数次爆发流行‘8。（表1）。这些CRKP菌株对多粘 菌素和替加环素以外几乎所有的抗生素耐药，极少一部分CRKP体外实验中对部分氨基糖苷类抗生素敏感，但是令人沮丧的是这部分的耐药报道也越来越多。 
          二、产碳青霉烯酶是CRKP主要的耐药机制目前认为CRKP产生的碳青霉烯酶主要有A类的肺炎克 雷伯杆菌碳青霉烯酶( KPC)和以锌离子为活性中心的B类金属B一内酰胺酶( MBLs)。 表1 CRKP在世界范围内引起的爆发流行 1．肺炎克雷伯杆菌碳青霉烯酶 世界范围内的CRKP暴发流行都与KPC有关。KPC属于A类p一内酰胺酶，Bush分类法中的2f类，它具有广泛的抗p一内酰胺类抗生素活性，包括青霉素、头孢菌素、单环类抗生素 以及碳青霉烯类[iI]，但可被克拉维酸钾抑制。通过对KPC酶 结构的研究以及和SHV-I、'rEM-i等广谱B一内酰胺酶比较，发现KPC可以通过酰化和脱酰作用，使催化活性位点结合碳青霉烯类等这类较大的水解底物12]。世界上第1株CRKP携带的 就是KPC-I型碳青霉烯酶，该菌株对亚胺培南和美洛培南的低抑菌浓度为16 yg/ml”。。DNA测序结果显示，KPC-1的碱基序列与来源于粘质沙雷菌的SME-I型碳青霉烯酶有45%同 {原性，与NME-A、IIUI-1和SEM-l等3种碳青霉烯酶的相似性 > 90%，提示KPC-1可能与这3种碳青霉烯酶具有相同的祖先．在KP中检测到的KPC基因都是由质粒携带的。目前为止 一共报道J' 19种KPC( KPC-I - 19)，KPC-2和KPC-3是常见的类型 、（KPC-I经过反复测序发现其实就是KPC-2）。KPC基因位于转座子Tn4401( Tn3)上，上下游序列保守，提示它的祖 先来源比较单一法国Naas等报道的KPC酶编码基因位于大小为10 kb的Tn4401转座子上，其周边序列与分离自美国马里兰的肠道沙门菌中的KPC型酶基因的DNA周边序列一致。美国学者Bratu等”1发现1株大肠埃希菌中KPC-2基因的上下游周边序列与先前报道的肠道沙门菌和肺炎克雷伯菌中的序列相似我国分离的KPC基因位于60 kb的质粒上，基因背景和国外有所不同。KPC基因凭借可移动元件能迅速 地在不同菌株和菌种间扩散，这是KPC在世界范围内多种属间得到广泛传播的重要原因。 KPC与医院感染死亡率密切相关。Gasink等…71研究r 56例 产KPC的KP菌感染患者，经多变量分析发现KPC感染的独立 危险因素有，1严重的基础疾病；(2)喹诺酮药物的先导使用。 盔KP中携带KPC基因的接合型质粒上同样发现了耐喹诺酮药物的qnr基因（主要是KPC-2和qnrB4，KPC-3和qnrB19）。 氟喹诺酮药物的使用也会使细菌对其它非喹诺酮药物耐药； 广谱头孢菌素的使用。有学者同样通过对碳青霉烯类抗生素耐药KP感染患者和碳青霉烯类敏感的KP感染患者的临床资料进行对比研究，发现留住ICU时间过长和分离KP前患者 至少接受一种以上抗菌药物的治疗，也会增加患者感染产KPC菌株的风险。 
          2．金属p一内酰胺酶MBL。是一类对氨曲南敏感的碳青霉烯酶，其活+性中心需要金属锌离子的参与，故称为金属p一内酰胺酶KP中发现的VIBLs主要是VIM-I和VIM-4。1997年在意大利发现、l、1型MBLs，当时并未波及亚洲。然而就在世界卫生组Ju( WHO)宣布甲型HINI流感大流行结束的第2天．《The LaInfectiou。Di。ea。es》报道了1例曾在印度新德里医院接受过；青 疗的印度裔患者的尿培养中，分离出了产新德里金属p一内 酰胺（New Delhi me[x]ta110_[3-lactamase．IxIDM-1）的KP菌株，该细 菌由于NDM-I及其他耐药基因的作用，对现今几乎所有类型的抗生素都具有耐药性。 
          3。科学家们发现，编码I\DM-I的基因 blaNDM-1和既往已知的几种MBLs基因均不相同。NDM-1共 有269个氨基酸，分子大小约为27 500 kDa.它与VIM-1 .VIM-2的氨基酸序列的相似性为32. 4%，并在酶活性位点附近具有独特的氨基酸残基以及插入序列，能与碳青霉烯类抗生素更紧密 地接合。bl。NDM-1位于1个180 kb的质粒上’blaNDM-I上游序列的2个区域中还存在能够抵抗利福平、红霉素、链霉素、氯霉素等抗生素以及消毒剂和磺胺药物的多种耐药基因。有此 类耐药质粒的细菌可以耐受除氟喹诺酮和多粘菌素以外的所有抗生素．该患者粪便的E．coli中也存在携带blaNDM-1质 粒，这很可能就是耐药质粒在患者体内发生菌种间接合的结果。紧接着2010年8月，英国、印度、巴基斯坦、瑞典和澳大利 亚等国学者联合进行研究，在印度、巴基斯坦和英国共分离得到180株含有l，1。、DVl-I质粒基因的细菌，其中有些菌株中还
不止有1个质粒i：带有l，laHDM-1基因。这些细茵中大多数为KP菌株，这一结果发表在2010年8月11日的《The La“081Infectious Dises，杂志|二’ 目前世界上许多国家仍有关亍 NDM-1的散发病例报逼 
          三、碳青霉烯酶检测手段还需完善有趣的是，cRKP并不是直接出现在碳青霉抗生素明显的耐药，可能仅仅表现为低抑菌浓度mic在敏感和中敏的 范围内波动。与MIC 测定相比，肉汤稀释法具有更高的敏感 性：。一般来说，至少对一种碳青霉类抗生素中敏感或耐 药，或者对第三代头孢菌素加头孢噻肛、头孢他啶、头孢曲松 头孢哌酮或头孢唑肟耐药的细菌，就应该进一步检测。厄他培南是临床常规药敏实验中筛选是否碳青霉酶的低底物。 改良霍奇实验(MTH)是美国临床实验室标准化协会（clsl）用于碳青霉烯酶的表型检测筛选的方法。mth基于待 测菌产生的碳青霉酶水解灭活美洛培南或厄他培南原本被抑制的大肠埃希菌得以继续生长的原理，用于判断绌困 是否产碳青霉烯酶。但是该方法不能鉴别碳青霉烯酶的种类， 另外存在一些局限性：(l)产CTX-M型ESBL和AmpC酶的菌 株会出现假阳性。CTX-M型基因或者AmpC的过表达（渗透性 的改变），会明显影响到厄他培南的MIC值，降低了该方法的特异性“。因此在CTX-V流行的地区，需要采用其它更有效的 检测方法。(2) MBLs具有微弱的碳青霉烯酶活性，因此产 MBL。的菌株有出现假阴性的可能”一(3)MTH检测产NDM-1的KP菌株的可靠性仍待验证‘”=Mueller-Hinton培养基替换 M。cConkey培养基可以提高MTH在检测MBLs和OXA碳青霉 烯酶方面的敏感性，只是这种改进还没有系统评估过：利用 KPC对硼酸盐及其衍生物的敏感性也可以检测产KPC菌株的 表型。硼酸盐的衍生物与B一内酰胺环结构相似，在二十世纪80年代被当作C类p一内酰胺酶的可逆性抑制剂，一直作为检测 c类B一内酰胺酶的探针。2008年，Pasteran等‘24 3发现苯硼酸和3一氨基苯硼酸等硼酸盐具有更优先抑制KPC酶的特性，紧接着j'UL就出现了利用和碳青霉烯酶结合的硼酸来栓测产KPC酶 的细菌耐药表型的报道, 2 5]。但是用硼酸盐为基础的检测产KPC菌株的经验仅仅局限于KP。由于硼酸衍生物是AmpC酶 的潜在抑制剂，因此对于产AmpC酶的菌株会出现假阳性，[25]抑制头孢茼素酶的邻氯青霉素钠可以部分改善这个问题‘2副。 同时需要指出的是，基于硼酸的产KPC的KP菌株检测方法在合并产VI\I时效率大大降低：
          大量研究已经证实，聚合酶链反应( PCR)可以成功用于单 一碳青霉烯酶的检测，多重PCR和实时定量PCR( RT-PCR)用 于多种碳青霉烯酶的确定且节约检测时间‘26。。利用RT-PCR的熔解曲线还可以区分检测的碳青霉烯酶种类’2”。目前已经 有主要类型的碳青霉烯酶PCR和探针试剂盒。尽管厂家声称 这些试剂盒可用于临床样本的直接检测’2 8。，但它们的诊断有效性仍需要系统评估。微阵列技术是近发展起来的针对快速有效的确定多耐药菌株的方法。Check- KPC ESBL微阵列以及它的升级版，已经成功应用于检测大量的B一内酰胺酶基因，包括许多与临床相关的碳青霉烯酶基因。上述所有的分子检测方法 针对的都是已知的基因，因此不可避免会漏掉未知基因CRKP主要在糖尿病和免疫缺陷患者中引起重症感染．运长患者住院时间，增加患者死亡率对于这类感染患者，治 疗必须有效、积极且起效迅速二目前临床有关cRKP引起感染的治疗数据不多，仅有少数病例或单个病例的报道。临床可选择的有效抗菌药也非常有限，无论是以替加环素为代表的新 型抗生索还是老药新用的多粘菌素都不能完全解决这个问题。 CRKP感染联合用，但是采用何种优联合方式仍待确立。在缺乏新结构、新靶点抗菌物的现状下，有计 划、有目的地合理使用抗菌物，演唱现有物的使用寿命，是当前可行之有效的方法。