微小核糖核酸与干细胞移植治疗心肌梗死的研究进展

         摘要微小核糖核酸( miRNAs)是一种内源性非编码调控单链小分子核糖核酸，可通过与目标信使核糖核酸 ( mRNA)结合，调控基因的转录后翻译过程。有研究显示miRNAs参与修复受损心肌。此外，越来越多的研究发现不同的miRNAs可参与干细胞功能调控，调节干细胞存活、迁移、分化等过程，进而通过改善移植干细胞命运，提高心肌梗死后心功能。本文旨在对miRNAs与干细胞移植治疗心肌梗死的研究现状及所面临的问题进行综述。 
         关键词心肌梗死；微小核糖核酸；干细胞移植；再生治疗 
         冠状动脉疾病在我国乃至全球发病率及死亡率都高居首位，其中心肌梗死是临床常见急危重症，目前的治疗方法虽 然能显著改善心肌梗死患者的临床预后，但是因坏死的心肌 细胞难以再生，存活的心肌经历了缺氧及心脏重构，致使心脏功能严重受损。目前干细胞移植治疗心肌梗死，被认为是 再生坏死心肌细胞，修复梗死心肌具前景的治疗方法，各种类型干细胞已用于实验及临床研究，然而不管何种类型干细胞均存在自身优势与局限性。骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死可显著改善其心功能，然而也有研究显示了骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的不确定性，近期的几个大型 临床实验中对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的确切疗效亦无突破性进展。 胚胎干细胞及多能诱导干细胞是到 目前为止是具潜力替代坏死心肌的种子细胞源，但首先得解决其临床应用的安全性及伦理问题。心脏干细胞不仅可定向分化为心肌细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞，并具有组织特异性与低免疫原性等特点。心肌损伤后，大部分心脏干 细胞即进入细胞周期、复制并定向分化为心肌细胞谱系，显 著改善心肌梗死后心功能。且心脏干细胞在I/II期临床试验中均获得可喜的成果。然而van Berlo等近期的一项 
         研究发现，成年及慢性疾病的小鼠心脏受损后，心脏固有干 细胞确实能产生出新的心肌细胞，但所占百分率仅为3%或 更低。可能在改善心功能方面并不具有显著性。由于心肌梗死后，心脏微环境变化极易导致移植干细胞发生凋亡，干细胞生物学利用率受限，减弱了其对心肌梗死的治疗疗效。因此，提高干细胞移植后的存活率及功能发挥将为转化医学发展与心脏疾病的防治开拓新的方向与策略。 
         1微小核糖核酸( miRNAs)的生物学特性 miRNAs作为新一代调控细胞命运的决定因素， 由Lee.等在秀丽线虫体内发现，随着对其结构及生理活性的研究发现：miRNAs是由长链初级核糖核酸( pri-miRNA)在细胞核内被核糖核酸酶Drosha剪切成具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNA)。随后pre-miRNA在转运因子Exponin-5的作用下进入细胞质，在细胞质内被剪切成 20~24 nt的双链miRNAs，双链miRNA。在特异性解旋酶作 用下形成单链，从而成为成熟的miRNAs并在细胞质内表达其生理活性。miRNAs的作用机制是通过结合到目标mRNA的非编码区( 3IUTR)，抑制靶标mRNA的翻译从而起到重要的负性调控作用。 
         目前为止，在人类组织细胞中发现大 约有2 000个miRNAs参与调控人类总基因的30%—500-/0的表达。研究还发现，在不同组织不同细胞miRNAs的表达谱及序列特征均有所不同，甚至细胞不同发育分化阶段均会出现miRNAs的差异表达，起到调控细胞“定时、定向”分化的作用。且每个miRNAs可同时有多个靶基因位点，而每个靶基因位点可能同时受多个miRNAs调控，可见miRNA。种类繁多，其靶基因位点及功能作用复杂多样。 
         2 miRNAs与干细胞功能相关性 虽然目前各种成体多能干细胞，胚胎干细胞，及诱导重组 干细胞已成功用于治疗缺血性心肌病并改善心梗后心功能一21。 然而干细胞移植治疗心肌梗死仍处于初级阶段，在临床试验 及动物模型实验的长期观察中发现：(1)各种类型干细胞均存 在移植存活率低的问题，尤其是从衰老机体或疾病状态下获 取的干细胞，其存活及功能障碍更为明显；(2)心肌梗死后移植干细胞募集到梗死区及与原位细胞长期整合作用在目前的大多数研究均未见成效；(3)移植干细胞分化而来的功能 心肌细胞十分有限，是否能够在体内长期维持，疾病及衰老 状态是否影响其心源性分化潜能目前均尚未得知。
         因此，现 已采取多种措施改善移植干细胞命运及功能，提高其修复梗死心肌的有效性。由于miRNAs参与调控基因表达网络并具有容易被小分子干扰等特性，因此可用于干细的胞移植前处 理。近年来，随着对miRNAs与干细胞的研究发现，在多种 干细胞中均存在各自特异的miRNAs表达，对干细胞的生物学活动具有重要的调控作用。以往研究显示几种miRNA。家族成员可维持胚胎干细胞的多能性，并且将不同的miRNA。 联合过表达就足以诱导多能干细胞的产生；而一些miRNAs可部分抑制维持干细胞未分化状态基因的表达，并激活干细 胞谱系特异性基因，发挥促进干细胞分化作用，此 外，干细胞所释放的外泌体含有促进受损心肌组织修复的miRNAs。因此，干细胞的功能与miRNAs调控存在相 关性。事实上，在心血管疾病的发生发展过程中，不同的 miRNAs产生差异性表达，逆转差异表达的miRNA。可能使冠脉疾病患者的细胞功能发生改变
         2.1 miRNAs促进移植干细胞存活 心肌损伤后释放一系列炎症因子及细胞因子，致使心脏微环境发生变化，极大影响了干细胞的存活，限制了移植细胞的功能发挥。近来的多项研究表明多种miRNA。家族成员 可促进心肌梗死后移植细胞存活。Huang等报道在小鼠心 肌梗死模型中，将过表达miRNA-126的骨髓间充质干细胞 移植到心肌梗死区域，可促进新生血管形成，修复梗死心肌。 另有报道称，过表达miRNA-21的骨髓间充质干细胞，可通 过改善线粒体膜电位损伤从而促进缺血缺氧条件下骨髓间充 质干细胞的存活。随后Hu等的研究显示，将分别携带miRNA-21、miRNA-24、miRNA-221的大鼠心脏干细胞在体外模拟的氧化应激环境下凋亡减少，更有趣的是，同时过表达这三种miRNAs比单独作用的抗凋亡能力强，其作用机制可能是与凋亡相关蛋白Bim结合，抑制其表达，从而发挥促细胞存活作用。此外，过表达miRNA-155可通过抑制受体相互作用蛋白1( RIPl)，进而激活苏氨酸激酶(AKT)信号通路， 促进氧化应激环境中心脏干细胞存活。由此可见，miRNA。 可增强移植干细胞抵御心梗局部缺血缺氧微环境的能力，为干细胞发挥生物学效应奠定基础。 
         2.2 miRNAs与干细胞迁移
         miRNAs不但能够促进移植干细胞存活，一些miRNA。还参与调控移植干细胞的迁移作用。基质衍生因子一1（SDF-1） 是CXC族趋化因子成员，可与其受体CXCR4相互作用，对干细胞迁移起关键作用。近年来研究显示：miR\A-150与 miRNA-146其中一个靶mRNA即为CXCR4，两者均可阻断干细胞膜表面受体CXCR4翻译过程，使SDF-l不能有效激活 CXCR4及其下游信号通路，削弱移植细胞迁移作用：因 此抑制这两种miRNAs的表达可促进移植干细胞迁移至心梗区域，发挥修复梗死心肌作用。然而有报道称m1RNA-150和 miNA-146可与多种凋亡相关蛋白结合，其高表达可对细胞存活作用产生积极的影响。MiRNAs对于生物体的调控作用是复杂多样的，利用miRNAs治疗疾病的过程中，需要权衡利弊：
         2.3 miRNAs促进干细胞分化 心肌缺血后再生坏死心肌细胞，建立有效的血运系统对保护心脏功能、改善远期预后起关键作用。若只有新生心肌， 则会由于持续缺血而不能改善心功能；若只有新生血管而 无新生心肌，则不能产生收缩压力。干细胞向心肌分化的过程是由一系列转录因子构成的信号网络通路调控，参与 该过程的miRNAs可对干细胞分化的各个环节进行微调。 可促进移植干细胞分化为心肌细胞及促进血管新生，修复坏死心肌组织。 miRNA-1是高度保守的miRNAs家族，也是迄今为止研究为广泛的miRNAs之一。miRNA-1是肌特异性miRNA． 在胚胎干细胞体外拟分化为胚体的过程中，miRNA-1可加强其中胚层基因的表达，使其向心肌方向分化。Fu等发 现过表达miRNA-1不仅能够促进胚胎干细胞分化为心肌细 胞，还能促进分化而来的心肌细胞的电生理成熟。随后也继 之报道过骨髓间充质干细胞转染miRNA-1后，可通过抑制Notch信号通路的下游转录因子Hes-l而发挥促进骨髓间充 质干细胞分化为心肌细胞的作用。Sluijter等研究认为 miRNA-1可通过下调组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)表达而促进人心脏前体细胞向心肌细胞分化。此外，Richart等将胚胎源性心脏干细胞( SSEAI+/MESPI+)移植到小鼠心肌梗死 区域，可显著促进新生血管形成，而在该类型心脏干细胞中 miRNA-21高表达，可以认为miRNA-21可促进心脏干细胞的血管新生作用。 
         2.4 miRNAs与干细胞旁分泌效应 大量研究证实心肌受损后移植干细胞可通过直接分化作 用改善心功能，但是由于干细胞分化的心肌细胞数量有限，不足以替补心脏受损丢失的细胞数量，因此，不能单纯用直接分化机制解释干细胞再生修复受损心肌的作用。有学者认为干细胞不但可以直接再生心肌组织，而且还能通过旁分泌 效应。增加细胞因子的表达，促进血管再生。并有报道称干细胞的旁分泌效应大于干细胞的直接分化作用。 对干细胞旁分泌作用的新研究发现，多种干细胞可释 放一种纳米级膜性小囊泡，称为外泌体，对细胞之间的相互作用至关重要。现已发现的外泌体中包含了相关miRNA。达764种。这些源于外泌体的miRNAs在调控干细胞分化（let-7，即miRNAs成员之一）、胚胎发育和器官发生（miRNA-1）、肿瘤 发生（miRNA-17-18/-19/19b）等生理和病理生理过程中发挥着关键作用。30，311。Chen等发现，心肌祖细胞的外泌体中富含miRNA-451，将心肌细胞与含该外泌体的培养基中共培 养时发现，心肌细胞内的miRNA-451含量增加，且细胞对 缺氧的耐受增强，由此证明心肌细胞可以内化心脏祖细胞释 放的外泌体，并利用miRNA-451启动细胞内信号通路而减少缺血再灌注心肌细胞的凋亡，促进损伤细胞的修复。 
        

          3面临的问题及展望
         目前干细胞介导治疗心肌梗死面临着移植存活率低， 作用机制不确定性等问题，但干细胞的临床应用前景仍然拥 有非常巨大的研究价值。miRNAs作为转录调控的关键分子，对干细胞的生物学功能起着至关重要的调节作用。近年来大 量关于miRNAs改善于细胞疗效的试验研究取得可喜成果， 但仍存在许多问题。首先，尽管miRNAs的抑制靶基因表达的作用非常强，但若需要过表达或抑制相关miRNA。需要实施转基因实验，即建立有效的小分子或病毒作为载体。虽然 近年来利用转基因技术治疗疾病已受到很大关注，欧洲国家 亦批准了个基因疗法，并且以病毒作为载体治疗心脏病的基因疗法被证实是安全有效的。然而大规模的临床应用还需要经过一个漫长的阶段。其次，miRNA。的生物学功能 还远远未能被人类所了解，作为一种普遍存在的调控分子， 后续研究将会发现更多的miRNAs，进一步阐明其靶基因位点和功能，以便确定对整个基因网络的全面影响是亟待解决的问题。后，目前对miRNAs靶基因的预测多是通过生物信息软件来完成，因此仍需进行充分的生物学实验来证实。 尽管应用miRNAs调控干细胞生物学功能面临诸多挑 战，但它对改善干细胞治疗缺血性心肌病的作用是有目共睹的，相信随着研究的进一步深入，上诉问题均会得以解决对miRNAs的了解也必将越来越全面和准确，这将为生命科 学研究和临床应用miRNAs介导干细胞治心肌梗死开启新的 时代。  
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         (收稿日期：2015-04-16） （编辑：王宝茹）