临床分子诊断技术在疾病诊疗中的应用价值与相关问题

分子诊断技术是指以DNA或RNA核酸为诊断材料，利用核酸扩增等分子生物学手段，检测靶标基因的存在、缺陷或表达异常，从而对疾病作出诊断的技术。目前分子诊断技术正处于高速发展时期，各类创新技术不断取得突破，除实时荧光PCR技术外，近年来分子诊断领域不断发展新的技术方法，应用范围也在不断拓展。

尤其是新冠疫情以来，在感染性疾病病原分子诊断细分领域，国内外的体外诊断技术研发机构和企业各显神通，各种新型核酸检测技术不断涌现。以新型冠状病毒核酸检测试剂的临床应用为例，目前获得国家食品药品监督管理局第三类医疗器械注册证的核酸检测试剂共计30余种，除了经典的实时荧光PCR法，还包括等温扩增技术等多种新型核酸检测技术。相比疫情前的分子诊断产品，我们切实感受到技术进步和工艺优化带来的新变化。本期主要对分子诊断技术，重点是在感染性疾病诊断的应用发展及存在的问题进行讨论。 （ 作者：陈瑜  单位：浙江大学医学院附属第一医院检验科/浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室/浙江大学检验医学研究所 ）

01 实时荧光PCR技术 实时荧光PCR（Real-time PCR）核酸检测技术仍然是当前分子诊断领域应用广的技术，逐渐成为病原诊断的主要手段之一。 通过引物设计、反应条件优化等，研发 能同时覆盖多个病原的多重PCR技术 是主要趋势，如罗氏Cobas 4800 HPV检测系统通过单管反应可以得到HPV 16型、18型和其他12种高风险亚型的筛查结果。 

同时，如何 实现实时荧光PCR快速扩增与检测 也是当前研究热点，例如研发新型热循环仪，针对性提高升降温速率，目前接触式热循环仪（如连续流、振荡流等）和非接触式热循环仪（如等离子体、激光等）的研究均取得一定进展。此外还可以通过改进PCR反应管的光传导和热传导效率，如Cepheid采用扁平结构的反应管，以实现快速实时荧光PCR扩增与检测。

还有研究者利用新型薄膜硅基微加热器，升温速率达到30°C/s。另外，通过采用极速反应酶和一步法提取试剂也能极大的缩短检测时间，如2020年上市的圣湘生物、卡尤迪和达安基因的新冠病毒快速核酸检测系统。 自动化 也是实时荧光PCR分子诊断发展的一个重要方向，尤其在新冠疫情常态化防控工作中，临床实验室的需求更加迫切，以罗氏COBAS 6800/8000全自动分子诊断系统为例，这类系统大大减少了手工操作，降低了环境和人员影响，更保证了实验室人员的生物安全。近年来，国内品牌如厦门安普利、上海仁度和安图生物的全自动核酸检测分析系统陆续获准上市。 

02 等温核酸扩增技术 核酸等温扩增技术是指在某一恒定温度、由特定酶作用完成靶标核酸扩增和相关信号检测的技术。相比于PCR核酸扩增技术，等温核酸扩增不需要热循环仪，基于该技术开发的分子诊断系统具有 操作简便、检测过程快速高效、仪器易小型化和易普及 等多重优点，因此，基于该技术研发的分子诊断产品特别适用于对检测速度要求较高的海关口岸，以及检测技术力量和基础薄弱的基层医疗单位。经过十多年的发展，目前已有多种等温扩增技术用于分子诊断领域，其中目前常见的核酸恒温扩增技术有环介导恒温扩增技术（LAMP)、依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）、切口和延伸扩增反应技术（NEAR）、重组酶聚合酶扩增技术（RPA）等。 LAMP技术是日本学者Notomi在2000年提出的，是目前分子诊断领域应用为广泛的恒温扩增技术，目前已开发有多种分子诊断产品及配套系统，如博奥生物公司晶芯®RTisochipTM-A，Meridian Bioscience的Alethia系列产品等。依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）是Compton在1991年提出的一种核酸恒温扩增技术，之后美国Gen-Probe公司以及上海仁度公司以M-MLV逆转录酶替代NASBA中AMV逆转录酶功能和RNase H酶水解活性，分别构建了转录介导扩增（TMA）和RNA恒温扩增实时荧光检测技术（SAT）。 切口和延伸扩增反应（NEAR）主要由逆转录酶、切口酶和恒温扩增DNA聚合酶驱动，并利用分子信标产生荧光信号用于结果分析。该技术开发的分子诊断产品以雅培公司的ID NOW COVID-19 assay为典型代表产品。重组酶聚合酶扩增（RPA）是Niall A. Armes在2006年创建的一种等温扩增技术。之后江苏奇天基因公司利用细菌或真菌的重组酶替代RPA技术中T4噬菌体来源的重组酶，构建了重组酶介导的扩增技术（RAA）技术，并利用该技术开发了系列分子诊断产品，目前研发的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（荧光RT-RAA法）已获得国家药品监督管理局第三类医疗器械注册证。 

03 数字PCR技术 数字PCR是（Digital PCR，dPCR）是近年来迅速发展起来的一种高灵敏核酸定量分析技术，早是在1999年由Vogelstein和Kinzler提出。 基于有限分割原理，dPCR技术可以根据反应体系中的泊松分布和阳性比例，以“数字式”计量方式对样品进行定量分析。 根据液体分散方式，目前dPCR主要有微反应室芯片式、集成流路式和微滴式三种主流方式，代表性应用平台分别为ThermoFisher公QuantStudio™ 3D芯片dPCR系统，Illumina Ventures的Naica crystal微滴dPCR系统，Bio-Rad公司QX100、QX200和RainDrop系列。 dPCR技术突破了荧光定量PCR技术中以检测荧光信号实时变化进行结果分析的方式，在检测过程中无需标准曲线或者参照基因即可对靶标核酸进行测定和比较。因此在检测过程中， dPCR技术结果定量不依赖于扩增曲线循环Ct值，且不受扩增效率的影响，特别在量化差异微小的样品区分中性能优异 ，目前在病原微生物检测、基因突变相关疾病检测、拷贝数变异检测、食品安全检测、基因表达分析等方面均得到广泛的应用。

04 分子床旁即时检验 分子床旁即时检验（Molecular Point-of-Care Testing，POCT），一般是指基于不同的核酸扩增原理，通过整合仪器、检测试剂和软件等多种技术原理设计的检测系统，易于小型化或微型化、操作便捷，适合在床旁、病房或中心实验室之外的其他特定场景（如社区医院、家庭检测等）开展即时检测，是目前分子诊断一个重要的发展方向。 样本前处理和核酸纯化提取一直是分子POCT检测中的难点，其解决方法一般是通过利用微流控技术结合特定物理或化学方式，将核酸提取纯化与扩增、检测集成到一起。目前一些商业化POCT平台，如GeneXpert利用小型超声破碎方式，FilmArray采用玻璃珠研磨等方式，都可以有效地实现核酸释放与进一步纯化。

但是这些方式对于POCT检测平台的系统复杂性、可制造性与可重复性等方面带来相应的挑战。为此一些POCT检测平台则采用免核酸提取方式，将样本利用裂解液直接处理后即用于下一步核酸扩增与检测，如雅培的IDNOW检测平台和卡尤迪公司的闪测™Flash20平台等。 但是同时要注意到，相比于常规核酸提取纯化及浓缩后进行的扩增检测方式，这种 免提取直接扩增的方式是以降低检测性能来换取更短检测时间与更少操作步骤 ，对于病原体核酸载量低的样本存在更多的漏检可能。 

05  病原宏基因组高通量测序技术 宏基因组高通量测序技术（me[x]tagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一种不依赖微生物培养的核酸检测技术，其依靠高通量测序平台和生物信息学分析流程，可以 在短时间内通过一次测试完成批量样本中全部微生物核酸数据的解读 。随着检测流程的逐渐完善和测序成本的快速下降，近年来，该技术已被广泛应用在包括中枢神经系统感染、血流感染、呼吸系统感染在内的各种感染性疾病相关标本的检测中，为疑难及危急重症病人的感染诊断提供了病原学证据，尤其在鉴定罕见、新发和混合感染病原体及排除感染方面体现出了较大优势。 

尽管目前还缺乏通用指南和建议以帮助mNGS在诊断实验室常规开展，但是来自于急诊、重症、感染及检验医学领域的国内外专家已经组织撰写并公布了多个mNGS临床应用的专家共识，从实验室环境和人员要求、临床适用症、标本处理、核酸提取、文库构建和测序、生物信息学分析和结果报告、性能确认方法、质量控制要求等均进行了阐释并提出了建议，这有利于mNGS本地化检测平台的的建立及规范化实施。 

06   分子诊断技术在其他热点诊断领域中的应用 近年来，随着人类基因组计划的顺利实施，许多与人类健康相关的基因功能得到了诠释，除了在病原诊断领域之外，分子诊断技术在肿瘤诊断、遗传病诊断以及产前诊断中也得到广泛应用。 长链非编码RNA、肿瘤循环DNA、外泌体等新型肿瘤标志物的发现，赋予了肿瘤实验诊断全新的内涵， 肿瘤分子诊断已经成为分子诊断的重要组成和研究热点 。多种高精度分子生物学技术正在被用于肿瘤相关诊断，在肿瘤分子分型、个体化治疗方案制定、预后评估中发挥着日益重要的作用。近期，研究人员结合微流控芯片通量高与数字PCR灵敏度高的优势，建立一种基于微流控芯片和数字PCR的乳腺癌基因HER2的突变检测技术，实现了对HER2突变高通量检测。针对高通量测序技术在痕量肿瘤ctDNA检测灵敏度低的难题，有研究人员研发了一种基于深度测序肿瘤个体化建档法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）的集成数字误差抑制增强平台的新方法，该方法实现了液体活检的EGFR分析，检测非小细胞肺癌患者ctDNA水平低至0. 004%。 

遗传性疾病由于病种繁多，临床表现复杂多样，且多为罕见病，临床上极易发生漏诊、误诊。 分子诊断技术的应用和发展极大地改变了疾病的诊疗模式 ，使遗传病的诊断与防治困境得以改善。DNA 微阵列芯片突变分析技术因其固相杂交而具有的并行性和高通量等特点，已被广泛用于肝豆状核变性的临床诊断，研究人员已开发了一种可检测87 种ATP7B 基因突变的DNA 微阵列芯片，实现了肝豆状核变性ATP7B 基因突变的快速筛查。

小结与展望

分子诊断技术的发展与应用在感染性疾病、遗传病、肿瘤的诊断和治疗中发挥了极其重要的作用，尤其是以等温扩增技术、dPCR技术、高通量测序技术等为代表的新型分子诊断技术的兴起及向临床中的转化应用，极大的弥补了传统方法在检测范围、敏感性、特异性及周转时间等多方面的不足。在未来的发展方向上，分子诊断技术将在快速便捷、高灵敏、高准确性、高度自动化集成化、高通量的方向上持续优化和转化，促进临床疾病的早期诊断和治疗。但必须明确的是，当这些新兴分子诊断技术不断被引入用于临床标本的检测时，临床实验室务必做好内部质量管理、性能确认、临床沟通和结果解释，确保检测系统适用于拟检测标本的预期用途，促进技术在临床应用中的有序发展及合理使用。