革兰氏阴性菌群体感应信号分子对宿主细胞的影响

 群体感应(quorum sensing, QS)是原核生物中一种基于分子信号的通讯机制。在基本模式下，某些细菌释放的信号分子被群落中其他成员的胞内受体或膜结合受体感知，导致同源基因信号分子合成和同步活动。这种调节机制对于细菌与宿主的共生关系以及毒力和生物膜的形成至关重要。值得注意的是，群体感应信号分子(QSSMs)不仅能够控制微生物群落行为，还可以调节宿主细胞的生理状态。本文对革兰氏阴性菌群体感应信号分子在调节宿主细胞功能和肠道健康中的重要性进行了全面的综述，并提出通过阻断群体感应信号分子发挥其功能的途径来应用于防治人类和动物疾病的可能性。  

综述目录

1 前言

2 革兰氏阴性菌QSSM的特征

3 革兰氏阴性菌QS系统

4 QSSM AHL对宿主细胞的影响及其潜在机制

5 QSSM AHL对宿主肠道健康的影响及其潜在机制

6 结论

主要内容

1 前言

国际学术界将多种微生物共同生活的系统称为微生物群落，也称为微生物区系。然而，许多年前，研究人员发现细菌间可以相互通讯，通过这种通讯，它们获得了协调运作的能力。细菌间通讯主要依赖于微生物群体感应(QS)。QS的概念早由Fuqua等人提出，指只有当细菌数量达到一定密度时才会发生的感应现象。据报道，在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中都存在QS，并且在细菌感染中经常观察到QS信号分子(QSSMs)的局部浓度升高。QS已成为微生物学领域的一个重要研究领域。20世纪60年代，Tomasz等人在肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)中发现了第一种QSSM。随后的一项研究表明，QS系统广泛存在于各种微生物种群中。随着新的研究进展，研究者发现QSSM不仅可以调控微生物群体行为，还可以调节人类致病菌中毒力因子的表达，逐渐引起了公共卫生领域的关注。

细菌群体感应(QS)是细菌交换细胞内或细胞间信息、协调种群行为、调节基因表达的机制，所有这些都取决于种群密度。当一个细菌群落达到一定密度时，它通过分泌可扩散的信号小分子(也称为QSSMs)来启动与细菌群落密度相关的基因表达。QSSMs扩散到环境中，当环境中的信号分子达到一定的阈值浓度时，它们会诱导细菌中依赖于细胞密度的特定基因的表达，从而导致细菌在群落规模上表现出新的行为特征，如生物发光、调节毒力因子分泌、芽胞形成或生物膜形成、细胞分化、运动和胞外多糖形成。目前已经确定了多种微生物相关的QSSMs。对于革兰氏阴性菌，大多数QSSMs属于N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)家族。不同AHLs之间的主要区别在于N-侧链的长度、3-碳位置的取代基以及侧链中是否存在一个或多个不饱和键。

以往对QS的研究主要集中在微生物间的相互作用。近年来，QSSMs对宿主细胞功能的直接影响也引起了广泛的关注。QSSMs是脂溶性小分子，很容易渗透到细胞内影响细胞功能。本文综述了国内外有关微生物QS的研究现状。基于对QS理解的新进展，我们还强调了QSSM AHL与宿主细胞之间相互作用的重要性，包括AHL在哺乳动物宿主细胞中的作用和潜在机制、AHL与肠道健康的关系以及AHL导致肠屏障功能障碍的机制。微生物QSSM的多靶点可能为细菌性感染性疾病的诊断和治疗提供了新的可能性。

2 革兰氏阴性菌QSSM的特征

i)小分子量：革兰氏阴性菌QSSM，如AHL及其衍生物、寡肽、γ-丁内酯等，都是可以自由进出细胞或由寡肽渗透酶分泌到环境中并在环境中积累的小分子。ii)物种特异性：AHL在革兰氏阴性菌中具有强烈地特异性。通常，革兰氏阴性菌使用LuxR型受体，这是一种细胞质转录因子，可以检测由伴侣LuxI型合酶产生的AHLs。iii)对生长期和细菌密度的依赖性：一般情况下，革兰氏阴性菌QSSM在环境中的积累在细菌生长的对数期或稳定期达到较高的浓度，此时它调节了大多数基因的表达。此外，细菌生长稳定期的上清液可以在培养阶段引起细菌生理状态的变化(较低的细菌密度)。iv)在革兰氏阴性菌感染中的调节作用：许多产生QSSM的革兰氏阴性菌属于动植物致病菌或共生细菌，其在细菌与宿主的相互作用中起着重要的调节作用。

  3 革兰氏阴性菌QS系统

革兰氏阴性菌可向周围环境释放一类小分子信号因子(AHL)，该因子可自由进出细菌，AHL在QS系统中起着关键作用。表1显示了不同革兰氏阴性菌QSSMs及其功能的信息。

AHL早在海洋细菌费氏弧菌(Vibrio fischeri)的生物发光系统中发现，这种现象与细菌的种群密度呈正相关。对于革兰氏阴性菌，由LuxI/LuxR组成的QS系统研究广泛。以费氏弧菌为例，该菌的LuxI同源基因负责QSSM AHL的合成，而LuxR同源基因作为AHL受体被激活，进而调控多种下游基因的转录。AHL介导的微生物间信号转导可调控革兰氏阴性菌的多种功能，如毒力因子的产生、抗生素和胞外多糖的生物合成、细胞聚集、进入稳定生长期等。在细菌呈指数增长的过程中，AHL在细胞质中合成并通过细胞膜扩散，从而到达细菌外部并在环境中积累。当AHL达到特定的临界浓度时，LuxR与AHL结合形成LuxR-AHL复合体，该复合体可激活相关基因的启动子，启动靶基因的转录(图1)。LuxR通过使用AHL作为折叠开关来稳定其结构，并在AHL缺失时自动降解。许多具有QS的细菌可以产生一种以上的AHL分子。例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)可以同时产生C4-HSL和3-oxo-C12-HSL，不同类型的AHL分子调节微生物群体行为的功能和机制可能存在差异。此外，一些研究人员发现，一些细菌缺乏与LuxI功能相似的基因，导致细菌无法自行合成AHL。有趣的是，这些细菌编码LuxR的同源蛋白SdiA，该蛋白可以感知其他细菌产生的各种群体信号，并通过窃听机制调节其自身QS相关基因的表达。

在以AHL为QSSM的革兰氏阴性菌QS系统中，信号转导途径多样。目前铜绿假单胞菌的研究为成熟，其主要包含四个QS系统。第一个是lasR/lasI系统，由转录激活因子lasR和乙酰高丝氨酸内酯酶lasI蛋白组成。LasI指导QSSM N-3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯(3-oxoC12-HSL)的合成，并在主动运输过程中将其分泌到细胞外。3-oxoC12-HSL能在一定阈值浓度下结合lasR，激活碱性蛋白酶、外毒素A、弹性酶等毒力因子的基因转录，从而增加铜绿假单胞菌毒力基因的表达。第二个是rhlR/rhlI系统。RhlR是一种转录调节因子；RhlI编码AHL合成酶。该系统产生高丝氨酸内酯QSSM，其结构为C4-HSL，可自由通过细胞膜，调节大量基因的表达，如几丁质酶、氰化物、绿脓素和其他基因。假单胞菌喹诺酮信号(PQS)是发现的铜绿假单胞菌的第三个QS系统。喹诺酮信号系统的信号分子具有抗菌活性且不溶于水，其利用细菌间信号转导的机制尚不清楚。它可能涉及通过胞吐样转运机制在细菌之间传递PQS信号。PQS可以连接lasR/lasI和rhlR/rhlI两个系统。一方面，lasR/lasI和rhlR/rhlI控制PQS的产生；另一方面，PQS影响lasR/lasI和rhlR/rhlI的基因表达。这两者之间有着微妙的平衡。此外，PQS还发挥着调节细菌密度和释放毒力因子的作用。除上述三种QS系统外，铜绿假单胞菌的另一种QS辅助系统GacS/GacA系统，被发现并报道其在提高细菌传播能力、释放可可碱乙酸钠和促进生物膜形成方面发挥了重要作用。

4 QSSM AHL对宿主细胞的影响及其潜在机制 4.1 AHL对细胞凋亡的影响

QSSMs是一类脂溶性小分子，其可以通过扩散到达黏膜上皮或皮下组织，甚至扩散到脉管系统中。研究表明，AHL是革兰氏阴性菌QSSM，可以影响宿主真核细胞的功能。由于其脂溶性，AHL可以迅速进入哺乳动物细胞，诱导细胞凋亡。因此，AHL在诱导宿主细胞凋亡中起着直接作用。AHLs可以快速启动小鼠胚胎成纤维细胞的凋亡，激活caspase-3/7和8，使线粒体膜电位去极化，并将细胞色素c从线粒体释放到细胞质中，导致细胞和细胞核收缩，导致细胞死亡。将呼吸道上皮细胞暴露于AHLs仅1小时就会导致上皮细胞间的紧密连接解体。然而，有报道称一种膜穿透性泛caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)可以阻断这种损伤，这表明紧密连接的破坏是由AHL引发的细胞凋亡的早期事件。低浓度的AHL足以降低未分化的Caco-2细胞的活力，并通过抑制AKT的磷酸化而诱导凋亡，而AKT过表达可部分逆转细胞凋亡。此外，粘蛋白MUC3可保护上皮细胞免受AHL造成的损伤。AHL的促凋亡作用与细胞内Ca2+信号转导有关。用抑制Ca2+进入内质网的抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin)预处理细胞10分钟可以保护屏障免受AHL损伤并减少细胞凋亡。AHL强烈诱导巨噬细胞和中性粒细胞凋亡。此外，AHL以剂量依赖性方式促进精子凋亡，从而降低精子活力。AHL对癌细胞也有较强的促凋亡作用。

  4.2 AHL对免疫的影响

根据酰基链长度、双键和浓度，AHL可以不同程度地影响宿主先天免疫系统。对于巨噬细胞，AHL通常以多种方式降低其炎症反应，导致铜绿假单胞菌的慢性感染。结果表明，铜绿假单胞菌产生的AHL在RAW264.7小鼠巨噬细胞中具有抗炎作用，且呈剂量依赖性。同时，AHL诱导RAW264.7细胞分泌的TNF-α浓度降低，IL-10浓度升高。此外，有报道称AHL存在时巨噬细胞具有更强的吞噬活性。对于树突状细胞(DCs)，其作用因细胞类型而异。在AHL存在的情况下，脂多糖刺激可抑制人和小鼠DCs中促炎细胞因子IL-12和干扰素-γ的分泌。然而，相同浓度的AHL和脂多糖只能增强人DCs分泌IL-10的能力，而不能增强小鼠DCs分泌IL-10的能力。AHL对宿主适应性免疫也有一定程度的影响。AHL能抑制有丝裂原刺激和抗原刺激的T淋巴细胞增殖和功能，并能调节B淋巴细胞产生抗体。此外，AHL可通过线粒体途径诱导Jurkat细胞系凋亡，从而抑制DCs和T细胞的活化和增殖，并下调DCs上共刺激分子的表达。

4.3 AHL影响宿主细胞功能的细胞类型特异性和剂量特异性

AHL诱导哺乳动物细胞凋亡具有明显的细胞特异性。例如，大量体外研究表明，AHL可诱导气管上皮细胞、乳腺癌细胞、巨噬细胞和中性粒细胞凋亡，但对肝Hep2和肺CCL185上皮细胞系不具有诱导凋亡作用。AHL对哺乳动物细胞免疫的调节也具有细胞类型特异性，有研究报道AHL可以上调炎症细胞因子，但也有研究表明AHL可以减少细胞炎症。此外，AHL对宿主细胞功能的影响同样具有剂量特异性。在较高浓度(>25 μM)下，细胞内事件可能占主导地位，但在较低浓度(<10 μM)下，更敏感的受体驱动效应将占主导地位。较低浓度(10~30 μM)的AHL可通过抑制未分化Caco-2细胞中的AKT磷酸化来降低细胞活力，并伴有细胞凋亡。在临床环境中，胃肠道被认为是产生AHL的铜绿假单胞菌重要的栖息地，其与较高的患者死亡率相关。人体临床研究表明，铜绿假单胞菌具有黏附和穿透肠上皮细胞以及形成生物膜的能力。AHL存在于铜绿假单胞菌生物膜中，浓度高达300-600 μM。因此，我们前面列出的AHL影响宿主细胞功能的研究中使用的浓度具有生理学意义，这些研究有助于指导临床实践。

  4.4 AHL影响宿主细胞功能的潜在机制

虽然AHLs触发宿主细胞损伤的分子机制尚未明确，对哺乳动物细胞中已鉴定的AHL受体靶点的研究仍处于早期阶段，但已阐明了几种介导AHL活性的信号通路和机制。通常，当病原微生物及其代谢物入侵时，宿主通过模式识别受体(PPRs)激活先天免疫系统。toll样受体(TLRs)是PRR的一种，能够直接激活免疫反应。据报道，AHL可调节中性粒细胞吞噬作用并抑制DC抗原呈递，从而诱导促炎细胞因子并加剧气道炎症。AHL也被报道能够抑制脂多糖诱导的核因子-κB(NF-κB)激活，从而触发淋巴细胞死亡。已有研究证明宿主响应AHL不需要TLR。在之前的一项研究中，我们发现虽然AHL处理后TLRs表达发生了改变，但NF-κB磷酸化并未发生改变。此外，NF-κB转录活性抑制剂并不能减轻AHL诱导的氧化应激和细胞活力，表明TLR-NF-κB信号通路不参与AHL诱导的宿主细胞损伤。因此，AHL的效应功能似乎是通过一个独特的信号平台发生的。

脂筏是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域。脂筏是蛋白质停泊的平台，与膜信号转导和蛋白质分选密切相关。脂筏可能在内质网中形成，一些脂筏运输到细胞膜后可不同程度地与膜下细胞骨架蛋白交联。目前，关于脂筏是否介导AHLs对宿主的有害生物学功能尚未达成共识。由于AHL是一种脂溶性小分子，有报道称细胞膜上的胆固醇是AHL的潜在受体，AHL可以通过细胞膜上的脂筏运输到细胞内执行特定的生物学功能。脂筏的破坏者MβCD通过移除细胞膜上的胆固醇来破坏脂筏的结构，能有效抑制AHL诱导的Caco-2细胞通透性增加。然而，另一篇报道表明AHL可通过被动运输途径进入宿主细胞，与细胞膜几乎没有相互作用。研究结果出现这种差异的原因可能是由于使用的细胞类型不同，但脂筏和AHL之间的关系仍需进一步研究。

目前，AHLs调节宿主细胞功能的机制尚不清楚，宿主细胞结合AHLs的受体尚未确定。然而，有人提出过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)可能作为哺乳动物AHL的潜在受体。PPAR-γ是一种核受体，作为转录因子调节脂质代谢。以往对PPAR-γ的研究主要集中在调节脂肪细胞的分化，而对其介导细胞凋亡的研究较少。体外研究也证实PPAR-γ激动剂可以在体外诱导培养的T细胞凋亡，这表明PPAR-γ激动剂是一种潜在的抗炎分子，在严重炎症反应过程中发挥免疫功能障碍的作用。PPAR-γ表达增加也可诱导癌细胞凋亡，但对于神经元细胞则相反，PPAR-γ过表达或其受体激动剂罗格列酮都可以通过上调抗凋亡蛋白来保护线粒体，从而发挥抗凋亡作用。

对氧磷酶2(PON2)