微生物组学和代谢组学综合分析揭示了半干旱农场土壤微生物和代谢功能对磷肥的响应

磷的局部施肥在实现作物高产和提高养分利用效率方面具有潜在的益处，但土壤微生物与相关代谢周期之间相互作用的潜在生物学机制仍有待研究。

本研究中，我们将微生物学与非靶标代谢组学相结合，基于高通量测序和液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS），探索了磷肥浓度和施肥模式对小麦土壤微生物群落和代谢功能的影响。

结果表明，磷肥降低了细菌16S rRNA基因和真菌ITS基因的多样性，改变了土壤细菌和真菌整体群落结构和组成。磷浓度和施肥模式也干扰了土壤细菌和真菌共生网络的复杂性。

代谢组学分析表明，磷肥改变了土壤代谢物，差异代谢物富集到包括精氨酸和脯氨酸代谢、植物激素生物合成、氨基酸、植物次生代谢物、鸟氨酸衍生生物碱等在内的7个主要代谢途径。

此外，通过相关分析我们发现，微生物与代谢物的积累密切相关。

我们的结果表明，局部适当的磷肥在调节土壤微生物代谢中起着重要作用，它们在土壤中的相互作用为理解磷管理实践的改变如何影响复杂的生物过程和植物对环境的适应能力提供了有价值的信息。

测序序列及微生物丰度和微生物多样性

经过质控过滤后，我们分别从16S rRNA和ITS基因测序中获得1,473,243和2,486,782个有效标签。在97%分类水平上进行OTU聚类后，共获得了2,935个细菌OTUs和823个真菌OTUs。

稀疏分析显示，细菌16S基因在1,473,243深度下趋于平缓，而真菌ITS基因在2,486,782的测序深度下趋于平缓。

在微生物群落的多样性和丰富度方面，与对照相比，除120 kg P ha-1均匀施肥外，所有磷肥处理均增加了表层土16S rRNA样品中所观察到的OTUs数和Chao1指数；除60 kg P ha-1条带施肥（小麦种子5 cm下施肥）外，所有磷肥处理均降低了下层土壤的OTUs数和Chao1指数。

在表层土壤中，仅120 kg P ha-1条带施肥处理下土壤的Shannon指数高于对照土壤，所有施肥处理均降低了下层土壤的Shannon指数。

在表层土壤中，只有60 kg P ha-1的条带施肥增加了OTUs的数量以及真菌的多样性和丰富度（如Shannon和Chao1指数）；在下层土壤中，与对照组相比，所有磷肥处理均降低了多样性和丰富度指数。

简而言之，施磷浓度和不同的施磷模式会改变土壤微生物群落的多样性和丰富度指标。

基于16S rRNA基因和ITS基因对土壤细菌和真菌群落组成评估

基于PCA分析，我们评价了5个处理间微生物群落的变化。细菌和真菌群落的前两个主成分解释了基于OTU水平的总变异度。

这些地块揭示了5个处理下表层土壤和下层土壤中细菌和真菌群落的明显差异。其中每个处理的3个重复通常聚集在一起，并与其他处理分离。

沿PC1和PC2的各处理间较大的距离表明，磷肥对细菌群落结构的影响大于磷肥对真菌群落结构的影响。 细菌序列分布于43个细菌门，209个细菌科以及471个细菌属。

所有土壤样品细菌群落中的优势门为变形菌门（Proteobacteria，31.81%）、放线菌门（Actinobacteria，27.08%）、酸杆菌门（Acidobacteria，15.12%）、绿弯菌门（Chloroflexi，7.21%）以及芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，4.61%），这些细菌门占所有序列的80%以上。

丰度排名前10的细菌门还包括拟杆菌门（Bacteroidetes，2.33%）、厚壁菌门（Firmicutes，2.19%）、Rokubacteria（1.90%）、奇古菌门（Thaumarchaeota，1.87%）以及蓝细菌门（Cyanobacteria，0.51%）。

在上述细菌门中，施肥处理增加了表层土壤中绿弯菌门和奇古菌门的相对丰度，降低了变形菌门、芽单胞菌门和拟杆菌门的相对丰度（图1b）。

在下层土壤中，所有磷肥处理均降低了变形菌门、奇古菌门和拟杆菌门的相对丰度，但增加了放线菌门、绿曲菌门和厚壁菌门的相对丰度。

在属水平上，所有土壤样品中排名前10的细菌属包括节杆菌属（Arthrobacter，3.59%）、未鉴定的酸性细菌属（unidentified_Acidobacteria，2.82%）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas，2.67%）、Gaiella（1.89%）、芽球菌属（Blastococcus，1.87%）、Dongia（1.49%）、Skermanella（1.41%）、芽孢杆菌属（Bacillus，1.38%）、链霉菌属（Streptomyces，1.37%）、溶杆菌属（Lysobacter，0.10%），这些细菌的丰度占所有序列的20%以下。在所有处理的上下两个土层中，我们均观察到这些细菌属的相对丰度存在差异。

在表层土壤中，所有磷肥处理均增加了节杆菌、Gaiella和芽球菌属的相对丰度。这三种细菌在60和120 kg P ha-1的条带施肥处理中丰度高，而磷肥降低了芽孢杆菌和Dongia的丰度。

在下层土壤中，施加磷肥增加了节杆菌属、芽球菌属、Skermanella和芽孢杆菌属的丰度，但降低了鞘氨醇单胞菌属和溶杆菌属的丰度。

除了在门和属水平上存在的差异外，各种处理增加了不同细菌分类群的丰度。

以log10 LDA评分 > 4.0为标准，我们在门、科、纲、目、属或种水平上，在不同处理的上层土壤和下层土壤中分别鉴定出12个和4个生物标志物，它们代表了所有处理中表层土和下层土之间的差异物种。

 TP0代表未施加磷肥；TT60和TT120分别代表60 kg P ha-1和120 kg P ha-1条带施肥处理；ST60和ST120分别代表60 kg P ha-1和120 kg P ha-1均匀施肥处理。   

对于真菌而言，我们共鉴定到14个真菌门，188个真菌科以及307个真菌属。在门水平上，子囊菌门（Ascomycota，55.67%）、被孢霉门（Mortierellomycota，10.18%）、担子菌门（Basidiomycota，8.46%）、毛霉菌门（Mucoromycota，0.62%）、壶菌门（Chytridiomycota，0.49%）、球囊菌门（Glomeromycota，0.26%）、芽枝霉门（Blastocladiomycota，0.13%）、油壶菌门（Olpidiomycota，0.02%）、Aphelidiomycota（0.02%）和梳霉门（Kickxellomycota，0.02%）是所有土壤样品中丰度排名前10位的优势真菌门，这些真菌的丰度约占总真菌序列的75.87%。

在表层土壤的门水平上，与对照相比，所有磷肥处理均提高了子囊菌门、毛霉菌门、球囊菌门和油壶菌门的丰度。

但磷肥处理降低了担子菌门和壶菌门的丰度。在下层土壤中，所有磷肥处理均增加了子囊菌门和油壶菌门的相对丰度，而降低了芽枝霉门的相对丰度。

在属水平上，主要的优势细菌属（相对丰度排名前10的细菌属）包括附球菌属（Epicoccum，23.50%）、被孢霉菌属（Mortierella，8.70%）、赤霉属（Gibberella，4.54%）、镰刀菌属（Fusarium，4.54%）、Solicoccozyma（4.50%）、链格孢属（Alternaria，3.31%）、Cladosporium（2.20%）、Pseudombrophila（1.94%）、Botrytis（1.44%）和丝核菌属（Rhizoctonia，0.33%），这些真菌序列占所有序列的55.0%。

在表层土壤中，所有磷肥处理均提高了附球菌属和Cladosporium的相对丰度，但仅降低了丝核菌属的相对丰度。

在下层土壤中，磷肥施加提高了Cladosporium、链格孢属和丝核菌属的相对丰度，但降低了附球菌属、Botrytis、Solicoccozyma以及丝核菌属的相对丰度。

除门和属水平上存在差异外，5个处理组均富集了部分真菌。

以 log 10 LDA评分 > 4.0为标准，我们在门、科、纲、目、属或种水平上，在不同处理的上层土壤和下层土壤中分别鉴定出8个和20个生物标志物，这些生物标志物代表了表层土和下层土之间的差异物种。 

微生物网络分析

在不同施肥处理条件下，在表层土壤或下层土壤样本中，基于磷贫瘠组和磷充足组之间的相关性（Spearman相关性，P< 0.05）对土壤微生物网络进行构建。

对于条带施肥处理而言，磷贫瘠组的表层土壤和磷充足组的表层土壤的细菌网络分别由86个和87个节点以及200条和250条链接构成。

对于均匀施肥而言，其土壤微生物网络分别由85个节点（磷贫瘠）和80个节点（磷充足）以及384个链接（磷贫瘠）和255个链接（磷充足）构成。

 在条带施肥（a-b）或是均匀施肥（c-d）处理中，在磷充足（a，c）或磷贫瘠（b，d）条件下，基于16S rRNA基因测序所构建的表层土壤（0-20 cm）微生物之间的连通性。

节点（彩色点）代表网络中涉及的属，链接代表节点之间的关系。红线代表正相关关系（Spearman相关性，r > 0.7，P< 0.05），蓝线表示负相关关系（Spearman相关性，r < - 0.7，P< 0.05）。

不同的彩色点代表属所属的不同门。节点内的数字代表网络中的关键属。

对于条带施肥处理下，在表层土壤样本中，基于ITS基因所构建的真菌网络包括70