二代测序法与全基因组SNP芯片法在胚胎植入前地中海贫血检测中的比较研究

[摘 要] 

目的

比较二代测序法与全基因组SNP芯片法对胚胎植入前地中海贫血的检测性能。

结论

在胚胎植入前地中海贫血检测中，NGS法对HBA基因致病性判断性能更优，SNP芯片法在部分家系中存在无法排除胚胎重组的风险；两种方法对于HBB基因致病性判断性能相当。

地中海贫血是因珠蛋白基因缺陷导致的一种溶血性疾病，是全球分布广、携带/发病人群多的一种常染色体单基因遗传病[1]。地中海贫血以α型和β型为常见，编码ɑ-珠蛋白的HBA基因和编码β-珠蛋白的HBB基因的突变和缺失是直接原因。当前，我国对于地中海贫血的防控重点在于孕前及产前筛查、诊断，避免重型地贫患儿的出生。胚胎植入前单基因病检测技术（Preimplantation Genetic Testing for Monogenic，PGT-M），通过检测致病基因区域上下游一定范围的遗传学标志物，结合家系成员之间的遗传学关系及致病基因携带情况，构建单体型以区分致病胚胎和正常胚胎，避免移植携带致病基因的胚胎入母体，实现优生。随着高通量检测技术[7-9]的发展，二代测序和基因芯片已逐步应用于PGT-M，因此本研究拟开展二代测序（NGS）法和全基因组SNP芯片法的检测性能评价，为胚胎植入前地中海贫血检测选择适宜的方法提供数据支持。

0   1    材料与方法   

1.1 胚胎植入前地中海贫血诊断国家参考品

批号：360027-201901，包含4个地中海贫血家系总计20份样本。

1.2  主要试剂

DNA定量试剂，核酸纯化磁珠，SNP芯片试剂盒，单核苷酸多态性微阵列芯片，单细胞全基因组扩增试剂盒，多重靶向扩增试剂盒，测序反应通用试剂盒。

1.3 主要仪器

SNP芯片扫描仪，Life ECO基因扩增仪，高通量测序仪。

1.4 试验方法

1.4.1 国家参考品处理

国家参考品中的16份DNA样本在实验前取出复融混匀离心后备用；4份模拟胚胎样本（含3-5个细胞）采用单细胞全基因组扩增试剂盒进行多重置换扩增，产物经AMPure XP磁珠纯化后，Qubit荧光定量仪进行定量。

1.4.2 国家参考品检测

取1.4.1中处理好的国家参考品，分别进行如下检测：

全基因组SNP芯片法：通过iScan扫描仪扫描获得数据；

NGS法：在Miseq高通量测序仪上测序。

1.4.3  数据分析

将iScan和Miseq下机数据上传至嘉宝仁和公司自主研发的PGX Cloud云平台进行数据分析，选取HBA和HBB基因及上下游2M范围构建单体型，并统计有效位点数量。

0 2    结果     

2.1  数据质量  

由基因组DNA样本数据质量良好，而4个模拟胚胎活检样本质控参数的质量偏低（0.5959~0.7011）。

2.2  NGS法和SNP芯片位点数量比较

NGS法和SNP芯片法对探针的筛选方式不同，在HBA和HBB基因区域及上下游设计的位点数量不同。

2.3  HBA有效位点结果

2种方法在HBA基因上游2Mb范围内获得2个以上有效位点，但均未在基因下游0M~1M范围内检测到有效位点。在HBA基因下游1M~2M范围内， NGS法在其它样本上获得的有效位点数总体多于SNP芯片法，并且在1号和3号家系中，NGS法还检测到了短串联重复序列（STR）位点。

注：括号中的数字代表STR有效位点数量。

2.4  HBB基因有效位点统计

两种方法均能在HBB基因上下游各2 Mb范围内获得2个以上有效位点。

2.5  HBA单体型构建及家系分析

两种方法构建的单体型结果与国家参考品标明的致病性位点遗传关系一致，但由于SNP芯片法在1号家系男方HBA基因下游无有效位点，因此不能排除胚胎染色体重组风险。  

2.6 HBB单体型构建及家系分析

以4号家系SNP芯片数据构建的HBB单体型。两种方法在HBB基因单体型构建及致病性分析上表现相同的检测性能，且单体型结果与国家参考品标明的致病性位点遗传关系一致。  

0 3    讨论   

全基因组SNP芯片法的优势主要是通用性和一体化，因芯片上覆盖全基因组范围内的大量SNP位点，所以针对不同的单基因病，只需通过数据抓取的方式对目标区域进行分析即可；同时基于检测强度，还可给出染色体非整倍体信息[10]。而NGS法从检测成本考虑，全基因组测序的深度及分辨率不足以实现大多数单基因病的检出[12]，因此须通过多重PCR靶向扩增，对异常基因及其上下游区域进行富集后测序，才能达到较高的测序深度，此外NGS的缺点在于需要针对每一种单基因病定制靶向富集引物，且无法同时给出PGT-A检测结果。

另一方面，SNP芯片探针位点设计相对固定，在基因组特殊区域（如端粒区）检测能力不足，如需新增探针位点，要重新设计生产整张芯片，费用高昂，并且只能检测SNP；而NGS法检测方式更灵活，可根据临床实际情况，随时添加或删除检测位点，还可纳入STR遗传标志物信息，因此在解决疑难病例上更有针对性。

将两种方法设计的位点数量与获得的有效位点数量比较，可知虽SNP芯片法在大部分区域设计的位点数量较多，但有效率低于NGS法。

本研究中，针对HBA基因，在基因上游2M范围内，两种方法虽均能获得足够的有效位点，但在基因内部和下游2Mb范围内获得的有效位点数量大幅减少。究其原因，是因为HBA基因下游靠近16号染色体端粒侧，端粒区域多为高度重复区域，不利于芯片探针设计和检测，且芯片灵活性较差，在无法获得有效位点的情况下，不能通过个性化定制以增加其它标志物检测，存在一定的局限性，如该男/女方为致病基因携带者，则不能排除基因该侧在胚胎中的重组风险， 1号家系就正好是这种情况。而NGS法可对目标区域进行靶向捕获，在相同数量检测位点的情况下能获得更多的有效位点，数据有效性整体高于芯片法，且同时在1号和3号家系中检测到了STR位点，因此可给出胚胎致病性的明确判断。

总之，在地中海贫血HBB基因家系分析中，NGS法和全基因组SNP法通常均可给出基因致病性判断，但对于HBA基因，由于SNP芯片在部分家系中存在无法排除胚胎重组的风险，建议采用NGS法构建地中海贫血HBA基因单体型，成功率更高，从而减少因胚胎重组导致的误诊风险。