体内诱导CAR-T细胞：有望突破当前CAR-T细胞治疗的障碍

嵌合抗原受体T细胞 疗法 （CAR-T）在治疗恶性血液病方面取得了令人瞩目的成功，但目前自体CAR-T细胞疗法的全身毒性和复杂的制造过程阻碍了其更广泛的应用。通用型CAR-T细胞已经被开发出来，通过从健康人身上分离和编辑异基因T细胞来简化生产过程，但异基因CAR-T细胞遇到了安全问题，部分临床试验被FDA叫停。因此，迫切需要寻找新的方法来克服目前CAR-T细胞疗法的障碍。

在小鼠模型中，由装载CAR基因和基因编辑工具的纳米载体诱导的体内CAR-T细胞显示出了治疗白血病的效果以及更低的全身毒性。自体T细胞的原位编程避免了异体T细胞的安全问题，并且纳米载体的制造更易实现标准化。因此，体内诱导的CAR-T细胞有望克服目前CAR-T细胞治疗的诸多局限性。

该论文 综述了CAR结构、基因编辑工具和基因递送技术在免疫治疗中的应用，以及免疫细胞治疗的未来趋势 ，有助于设计和开发新的体内原位诱导CAR-T细胞。

嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）是一种新型细胞免疫治疗技术，它将合成受体结合到T细胞中，用同源靶向配体识别和杀死肿瘤细胞。自美国FDA批准CD19靶向的CAR-T细胞疗法以来，CAR-T细胞疗法在B细胞淋巴瘤患者中表现出了前所未有的治疗效果。然而，随着CAR-T细胞治疗的成就，细胞因子释放综合征 （CRS） 、神经毒性等许多全身毒性作用也被频繁报道。

此外，CAR-T细胞复杂的制造过程限制了这种治疗方法作为标准临床治疗的广泛应用。因此，迫切需要开发一种新型CAR-T细胞范式来克服这些障碍，并让这种治疗方法使更多的患者受益。

为了简化CAR-T细胞的复杂制造过程，来自健康人的通用异基因CAR-T细胞已在临床试验中进行了测试。通用CAR-T细胞可以是现成的，然后像普通药物一样注入患者体内，而不需要等待从患者体内分离出自体T细胞。然而，去年Cellectis公司的通CAR-T疗法UCARTCS1A临床试验期间的死亡案例引发了人们对异基因CAR-T细胞安全性的担忧。出于安全考虑，FDA还停止了来自Allogene公司的通用CAR-T细胞的临床试验。因此，我们需要新的策略来克服相关毒性，并简化当前CAR-T细胞疗法的制造过程。

由装载CAR基因的纳米载体和基因编辑工具诱导的体内CAR-T细胞对白血病显示出良好的效果。原位编程自体CAR-T细胞可以增强对肿瘤细胞的靶向杀伤，降低细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性等全身毒性。此外，纳米载体可以很容易地以标准化的方法制造。体内诱导的CAR-T细胞为克服目前CAR-T细胞治疗的障碍提供了一种潜在的解决方案。

本文综述了CAR结构设计、基因编辑工具、基因递送系统以及免疫细胞治疗的未来趋势。

CAR结构和进化

嵌合抗原受体 （CAR） 的结构具有模块化设计，包括抗原结合域、铰链、跨膜域和细胞内信号域 （图1A） 。抗原结合域通常是由单克隆抗体衍生的单链可变片段 （scFv） 分子，可与恶性癌细胞表面的抗原结合，跨膜结构域负责将CAR锚定在T细胞膜上。细胞内信号域通常包含T细胞受体CD3ζ链衍生的T细胞激活域，以及共刺激域，通常由含有CD28或4-1BB区域的基于酪氨酸的免疫受体激活基序组成 （也称为CD137和TNFRSF9） 。CAR结构的每个组成部分的变化能够微调CAR-T细胞产品的功能和抗肿瘤活性。

各种CAR结构被设计用来提高CAR-T细胞治疗的安全性和有效性。一旦设计的CAR基因被整合到T细胞中，T细胞表面的scFv会特异性地识别肿瘤相关抗原，并将CAR-T细胞与肿瘤细胞结合。在此之后，CAR-T细胞的细胞内信号域被激活，导致CAR-T细胞增殖并分泌杀死肿瘤细胞的细胞因子。

自2011年宾夕法尼亚大学Carl June和费城儿童医院 David Porter 将CAR-T细胞应用于临床治疗以来，CAR结构已经历经了五代发展 。第一代CAR含有细胞内刺激区和细胞外单链抗体，由于缺乏共刺激分子，这一代CAR-T细胞不能持续增殖。第二代CAR增加了一种共刺激分子，如CD28，或4-1BB （CD137） ，以增强CAR-T细胞的增殖和降低毒性。Yescarta™和Kymriah™这两款早获批上市的CAR-T细胞疗法是分别含有CD28和4-1BB的第二代CAR-T细胞。第三代CAR包括两个共刺激分子，如CD27、CD28、肿瘤坏死因子超家族4 （OX40，也称为CD134） 、4-1BB（CD137）或CD244。第四代CAR被称为TRUCKs，它结合了CAR-T细胞的直接抗肿瘤能力和递送的细胞因子的免疫调节功能。TRUCKs已经进入早期临床试验，使用一系列细胞因子，包括IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23及其组合。第五代则集成了一个额外的膜受体，以抗原依赖的方式控制CAR-T细胞的激活。

除了在CAR结构中添加新的功能分子外，许多研究为新的CAR结构选择了替代的肿瘤靶向位点。CD30在霍奇金淋巴瘤恶性细胞上表达非常强，而在健康淋巴细胞和造血干/祖细胞 （HSPC） 上表达较弱。CD30 CAR-T细胞疗法在CD30+恶性肿瘤的治疗中表现出优异的效果，而健康活化淋巴细胞和HSPC则不受影响。CD20是一种33-37-kDa的非糖基化跨膜磷酸化蛋白，有助于B细胞的发育和分化，CD20在晚期pre-B细胞和成熟B细胞中高表达，但在热休克细胞表面不表达。CD20 CAR-T细胞疗法在b细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗中已显示出前景，目前正被考虑用于复发或难治性CD20阳性慢性淋巴细胞白血病患者。Lym-1靶向人B细胞淋巴瘤表面的人白细胞抗原D-相关抗原 （HLA-DRs） 的构象表位。Lym-1与恶性B细胞的结合亲和力高于正常B细胞，Lym-1 CAR-T细胞对B细胞淋巴瘤表现出强大的抗肿瘤作用。一些替代的靶向位点与CD19结合形成双靶点CAR-T细胞。例如，将CD37和CD19结合到一个CAR中，生成能够单独或同时识别CD19和CD37的双特异性CAR-T细胞。CD79b也是CD19的一个补充靶向位点。CD19和CD79双特异性CAR-T细胞阻止了B细胞淋巴瘤从CD19 CAR-T细胞逃逸。一些替代的靶向位点具有联合靶向功能，作用于肿瘤细胞和肿瘤微环境。例如，CD123在霍奇金淋巴瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞中都有表达，因此抗CD123的CAR-T细胞可以共同靶向这两种细胞并同时杀死它们。CAR结构在不断进化，以提高目前CAR-T细胞疗法的疗效。

当前CAR-T细胞疗法的障碍

Kymriah™ （Tisagenlecleucel） 是被FDA批准用于某些类型B细胞淋巴瘤成人患者的CAR-T细胞疗法。三种已获批的CAR-T细胞产品Yescarta™ （Axicabtagene ciloleucel） 、TecartusE™ （Brexucabtagene autoleucel） 和Breyanzi® （Lisocabtagene maraleucel） 也被批准用于B细胞淋巴瘤的治疗。第五种CAR-T细胞产品Abecma® （Idecabtagene vicleucel） 用于多发性骨髓瘤治疗。

除了已获批准的5种CAR-T细胞产品外，还有大量的CAR-T细胞正在临床试验中进行研究，但目前的CAR-T疗法存在一些障碍，如相关毒性、免疫抑制肿瘤微环境和复杂的制造工艺，这些障碍阻碍了CAR-T疗法的更广泛应用。

目前CAR-T治疗相关的主要毒性包括细胞因子释放综合征 （CRS，也称为细胞因子风暴） 、免疫效应细胞相关神经毒性综合征 （ICANS） 和非肿瘤靶向毒性。CRS是由CAR-T细胞治疗后产生大量炎症细胞因子引起的，如IL-6、IL-10、IL-2和TNFα。CRS常引起发热、低血压、缺氧、器官功能障碍，甚至危及生命的不良反应。严重或危及生命的CRS发生率可达25%。ICANS是与CAR-T细胞治疗相关的另一种常见毒性，其特征是神经异常和后遗症，通常在CAR-T细胞治疗后1周内发生。ICANS引起的常见不良反应包括中毒性脑病伴失语、思维混乱和找词困难

非肿瘤靶向毒性是由于靶向蛋白在正常和恶性细胞上均有表达，例如，在恶性B细胞患者给予CD19 CAR-T细胞时，由于CD19 CAR-T细胞CD19+B细胞祖细胞，非肿瘤靶向效应将导致B细胞再生障碍性发育，并导致低γ球蛋白血症。

免疫抑制肿瘤微环境 （MVT） 抑制CAR-T细胞的活化，加速T细胞耗竭，免疫抑制MVT的不利因素包括缺氧、多种免疫抑制细胞、共抑制受体的持续表达。缺氧的定义是肿瘤MVT中缺氧。肿瘤MVT中的免疫抑制细胞包括调节性T细胞 （Tregs） 、肿瘤相关巨噬细胞 （TAMs） 和髓源性抑制细胞 （MDSCs） 。

目前CAR-T细胞的制造过程是一项非常复杂的工作，包括T细胞的收集、基因修饰和扩增，以及输注回患者体内，这些多步骤的技术和物流运输充满了风险。此外，长期和个性化的制造过程对建立标准操作程序提出了巨大的挑战。目前CAR-T细胞的制造过程昂贵且技术密集，这使得许多需要这种新疗法的癌症患者难以获取。

CAR-T细胞治疗中的基因编辑工具

CAR-T细胞治疗中常用的基因编辑工具包括ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9技术。ZFN是第一代广泛应用的基因编辑工具，可以实现有效、特异的基因编辑，但优化目标蛋白分子耗时较长。TALEN作为第二代基因编辑工具，比ZFN更经济，但仍需要较长的时间来优化系统。而CRISPR-Cas9技术因其简单、高效和特异性成为受欢迎的基因编辑工具。

以CRISPR-Cas9为代表的基因编辑技术的发展，使得CAR-T细胞的精确基因编辑能够通过去除T细胞的PD-1来生成抗耗竭T细胞。CRISPR-Cas9也被用于敲除正常细胞中的内源性抗原，如CD33和CD7，以减少重定向T细胞的非肿瘤靶向毒性。

目前，CRISPR-Cas9系统已用于至少21种靶抗原的CAR-T临床试验，其中CD19和BCMA这两个靶点占据了近一半。为了更广泛地使用CRISPR-Cas9系统来编辑CAR-T细胞，必须开发有效的递送方法。

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