中脑星形胶质细胞源性神经营养因子在脑缺血再灌注损伤中的作用

脑卒中是由于脑梗死、脑出血或蛛网膜下腔出血导致的中枢神经系统急性损伤，是世界范围内死亡和致残的主要原因，脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中的发病率高于出血性脑卒中，约占脑卒中总数的70%。近年来，静脉溶栓的普及和血管内治疗的开展给缺血性脑卒中患者带来希望，但血管再通后缺血性脑卒中区域血供的恢复会引起一系列不良的生化反应，包括活性氧的产生、炎症反应、脑细胞损伤等，导致受损部位神经元凋亡或坏死，加重患者缺血区域脑组织损伤和脑功能障碍，造成脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）。

中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（mesencephalic astrocyte‑derived neurotrophic factor, MANF）是一种进化保守的神经营养因子，属于脑多巴胺神经营养因子/MANF家族。既往研究表明，MANF在神经性系统疾病［如帕金森病（Parkinson's disease, PD）、阿尔茨海默病以及CIRI］中起着不可或缺的作用。本文就MANF的功能以及在CIRI中的作用及可能的作用机制进行综述，以期为进一步探寻CIRI的防治方法提供新方向。

1、MANF的特性与功能

MANF是一种分泌蛋白，相对分子质量约为18×103，在细胞内定位于内质网（endoplasmic reticulum, ER）和高尔基体，人类和鼠的脑、肝、心脏、脾、肺以及骨骼肌等组织中都有不同程度的表达，其中，脑组织中主要见于大脑皮质、海马、小脑浦肯野细胞以及丘脑和下丘脑。MANF由于独特的三维结构，除了与传统的神经营养因子一样可激活细胞内信号通路，调控神经元结构、功能和生存，在神经元的生长、存活和成熟中发挥关键作用外，还参与内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）以及调控炎症反应等病理生理过程，具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡等活性。

1.1、神经修复与保护作用

有学者通过向PD模型小鼠黑质内注射腺相关病毒血清8型载体‑MANF重组体发现，过表达MANF蛋白改善了PD大鼠的运动障碍，并抑制了多巴胺能神经元的变性。也有研究表明，PD大鼠颅内过表达MANF，在黑质内促进了多巴胺能神经元的存活，在纹状体内促进了多巴胺能神经纤维的再生，上调了机体内多巴胺的水平，并且长期（长达16周）改善了PD大鼠的旋转行为，推测外源性MANF对PD大鼠黑质纹状体多巴胺系统有长期的神经保护和神经再生作用。

Zhang等在PD α‑突触核蛋白模型多巴胺能神经元中特异性过表达MANF，也发现MANF可改善多巴胺能神经元的纤毛、树突、轴突存活率以及细胞核形态，缓解进行性神经元退行性变并预防运动缺陷；此外，MANF还可降低α‑突触核蛋白的聚集，恢复多巴胺水平，并挽救受损多巴胺能神经元的功能，发挥其神经保护作用。另外，Wen等通过腺病毒转导过表达MANF或在培养基中加入重组人MANF蛋白发现，外源性MANF可促进维甲酸处理的N2a细胞神经突的生长。

1.2、参与ERS

ERS是ER内稳态亚细胞损伤的病理过程，也是真核细胞的一种保护性应激反应。诸如缺血再灌注、营养不足、脂质过度负荷、钙浓度变化以及氧化应激等生理病理情况均能诱导ER内蛋白质的错误折叠，诱发ERS。未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）是一种通过抑制蛋白质翻译以及降解错误折叠蛋白的途径来缓解应激的细胞防御机制，有助于恢复ER的稳态，ERS可以触发UPR的激活，但ER的压力如果长期维持在高水平，UPR将会诱导细胞凋亡。

Li等通过在PD体外模型上敲低MANF发现，C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein, CHOP）、免疫球蛋白重链结合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein, Bip）和活化胱天蛋白酶‑3蛋白表达明显增加，细胞活力明显降低，表明内源性MANF可通过抑制ERS和细胞凋亡缓解PD的神经元损伤。Wang等研究发现，外源性MANF能促进正常和糖尿病患者角膜上皮创面愈合和神经再生，并且在小鼠结膜下注射MANF特异性干扰小RNA也可以阻止角膜上皮伤口愈合和神经再生，推测外源性和内源性MANF均能抑制高血糖诱导的ERS以及ERS介导的细胞凋亡。此外，Wang等研究报道，对特异性中枢神经系统MANF基因敲除的小鼠皮下注射乙醇和ERS诱导剂衣霉素（tunicamycin, TM）构建神经退行性变动物模型，发现MANF缺乏会加剧乙醇及TM诱导的神经元凋亡和ERS，而利用ERS抑制剂4‑PBA阻断ERS可以消除这种有害作用，这些结果表明内源性MANF可以通过改善ERS来保护神经元免受乙醇诱导的神经退化。Tang等研究发现，小鼠促阿片‑黑素细胞皮质素原神经元中的MANF敲低后，触发了ERS，并激活了下丘脑中UPR信号，引起ERS标志物（GRP78等）表达水平上调；而过表达MANF则可减弱ERS，进而刺激交感神经和棕色脂肪组织的活性，导致棕色脂肪组织产热增加，这表明内源性和外源性MANF可通过抑制ERS保护小鼠免受膳食肥胖的影响。

1.3、抑制炎症反应

NF‑κB是一个重要的转录调控因子，在炎症的起始阶段起着关键的调控作用。MANF在自身免疫性疾病和炎症疾病中上调，并且炎症可使MANF由细胞质转移至细胞核内发挥其抗炎、抗凋亡作用。研究表明，MANF可能通过其C端SAP样结构域与p65结合，从而抑制NF‑κB的激活，减轻脂肪细胞的炎症反应。Yan等通过小鼠肝脏特异性MANF敲除发现，小鼠的肝脏脂肪变性和炎症加重，而肝脏特异性MANF过表达则减轻了炎症反应，体外试验也得到同样结果，提示内源性和外源性MANF可通过抑制NF‑κB信号通路对非酒精性脂肪性肝炎起到保护作用。Hou等发现，利用脂多糖诱导小鼠发生急性肾损伤后，单核巨噬细胞特异性MANF敲除的小鼠生存率较低、血清TNF‑α水平较高、肾损伤更严重、肾组织中M1型巨噬细胞增多，推测这可能与肾脏微环境中NF‑κB信号通路的激活增强有关，表明MANF可通过抑制NF‑κB信号通路减轻肾脏炎症，对脂多糖诱导的急性肾损伤起到保护作用。Sun等也发现，用外源性MANF治疗小鼠皮肤炎症损伤后，血清TNF‑α、IL‑1β表达降低，IL‑10表达增加，表明外源性MANF可减轻皮肤炎症。

2、MANF在CIRI中的作用

2.1、CIRI

CIRI发生在缺血性脑卒中后的短时间内，脑组织功能由于缺血缺氧而受损，在恢复血液灌注后会再次对脑组织造成伤害，使脑组织的损伤程度进一步加重。CIRI的脑组织损伤既取决于血流减少程度，还与细胞内钙超载、氧化应激、兴奋性氨基酸的神经毒性作用、一氧化氮合成过多、能量代谢障碍、炎症反应、细胞凋亡和坏死等因素有关，导致CIRI的诸多因素或环节相互影响或互为因果，共同作用产生神经毒性，引起局部脑组织功能损伤。

2.2、MANF在CIRI中的作用

Caglayan等在小鼠脑卒中后3 d开始给予脑室内MANF治疗，持续28 d，通过一系列行为学测试评估发现，外源性MANF可促进脑卒中后神经功能恢复，提高神经元长期存活率，缓解缺血性损伤，减少迟发性脑萎缩和神经胶质瘢痕形成。Han等在小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）后2 h向缺血侧脑室注射重组人MANF蛋白，发现外源性MANF可抑制脑梗死区IL‑6、IL‑1β以及TNF‑α的产生，恢复血脑屏障的完整性，从而降低梗死体积、神经评分、脑水含量和中性粒细胞浸润率。Mätlik等在大鼠MCAO模型中也发现，脑卒中后2~3 d，在脑梗死灶周围区域过表达重组人MANF蛋白，降低了神经功能缺损评分，促进了大鼠的功能恢复，但并不影响脑梗死灶的体积；另外，MANF基因敲除小鼠MCAO后脑梗死体积增大，表明外源性和内源性MANF对脑缺血性损伤都具有神经修复和保护作用。

3、可能作用机制

3.1、抑制ERS和细胞凋亡

Yang等建立大鼠MCAO模型发现，MCAO引起UPR相关基因XBP1（包括XBP1u和XBP1s上调，MCAO后2 h于缺血侧脑室注射重组人MANF蛋白，抑制了局灶性脑缺血引起的Bip、磷酸化肌醇需求酶和XBP1的升高，但不影响CHOP的表达，提示UPR可能参与了MANF的神经保护作用，这表明MANF可通过调节ERS和UPR相关基因的表达来保护神经元，减少神经元凋亡。Yang等对MCAO大鼠缺血侧脑室注射外源性MANF蛋白治疗偏瘫大鼠，发现CIRI引起的胱天蛋白酶‑3裂解受到抑制，TUNEL阳性细胞数量也减少，表明MANF可能通过抑制细胞凋亡对缺血区域大脑皮质起到保护作用。Yu等利用重组人MANF蛋白预处理原代培养的神经元，在TM处理后发现，MANF预处理的神经元中TUNEL阳性细胞更少，表明MANF能减轻ERS诱导的细胞凋亡。孙瑞对人神经母细胞瘤细胞株SH‑SY5Y进行糖氧剥夺/再灌注（oxygen‑glucose deprivation/reperfusion, OGD/R），在给予重组人MANF蛋白后发现，由OGD/R上调的CHOP和胱天蛋白酶‑3裂解水平被抑制，表明MANF可通过抑制ERS引起的细胞凋亡进而改善OGD/R诱导的细胞损伤。Tseng等给予MANF基因敲除小鼠的神经干细胞OGD/R处理发现，MANF敲除的神经干细胞凋亡率更高，而给予重组人MANF蛋白后，缓解了OGD/R诱导的细胞凋亡，表明内源性和外源性MANF均可保护神经干细胞免受OGD/R诱导的损伤，抑制细胞凋亡。

3.2、抑制炎症反应

研究发现，外源性MANF在细胞核内通过其C端类SAP样结构域与NF‑κB p65亚基的DNA结合域相互作用，从而干扰p65与其靶基因启动子的结合，抑制p65介导的转录激活，因此MANF始终抑制NF‑κB依赖的靶基因表达和炎症滑膜细胞增殖，这一发现表明，MANF可能是炎症的负调控因子。在CIRI中，炎症反应也参与了缺血诱导的神经元损伤。Han等在MCAO小鼠缺血侧脑室注射重组人MANF蛋白发现，脑梗死灶周围区域IL‑6、IL‑1β和TNF‑α的产生减少，维持了血脑屏障的完整性，进而降低梗死体积、神经系统评分、脑含水量和中性粒细胞浸润率。Caglayan等也发现，小鼠CIRI后3 d向缺血侧脑室内连续微泵注入MANF蛋白后，降低了小鼠脑内促炎因子IL‑1β和TNF‑α的mRNA表达，抑制了炎症反应，促进了神经元的长期存活，减少了延迟性脑萎缩和神经胶质瘢痕的形成。另外，有研究报道称中枢神经系统缺血性损伤可导致星形胶质细胞活化，并释放促炎细胞因子，如TNF‑α、IL‑1β和IL‑6等。Zhao等研究发现，外源性MANF能减少OGD诱导的星形胶质细胞中IL‑1β、IL‑6、TNF‑α的分泌和mRNA表达的升高，抑制GRP78和NF‑κB p65的上调，从而减轻星形胶质细胞损伤，增强细胞活力。

3.3、调节免疫功能并促进神经干细胞的分化

Mätlik等发现，脑卒中后给予外源性MANF治疗可加速改善缺血性脑损伤大鼠的行为缺陷，增加皮质下巨噬细胞的数量，通过基因分析发现MANF诱导脑梗死灶周围皮质补体C3和Emr1基因表达上调，这两种基因都在小胶质细胞和外周免疫细胞（特别是单核细胞/巨噬细胞）中表达，表明MANF对梗死灶周围组织的保护作用可能与免疫功能有关。Yang等研究发现，利用骨髓间充质干细胞治疗脑卒中大鼠后，MANF表达上调，可直接诱导M2型小胶质细胞/巨噬细胞极化，促进大鼠受损的神经功能恢复，减少脑梗死体积，表明MANF在大鼠CIRI中通过免疫调节作用修复脑组织损伤。

Tseng等在体外培养的特异性MANF基因敲除小鼠的脑室下区片段中发现，OGD/R后内源性MANF可促进神经祖细胞的迁移；在神经干细胞培养基中加入外源性MANF蛋白发现，可促进神经元和胶质细胞的分化，从而增加成神经细胞的数量，表明MANF的神经再生活性有助于神经祖细胞的迁移和神经干细胞分化，从而增加脑卒中后大脑皮质中成神经细胞的聚集。

4、展望

MANF对多巴胺能神经元有选择性保护作用，在CIRI等中枢神经系统性疾病中保护神经元免受损伤，因此MANF具有治疗CIRI、PD和阿尔茨海默病等多种神经系统性疾病的潜力。MANF可通过抑制ERS、抗凋亡、抑制炎症反应、调节免疫功能等途径降低CIRI的死亡率，改善神经功能，减少脑梗死体积。但具体的作用机制尚未有定论，在广泛应用于神经系统性疾病临床治疗之前，其安全性及作用机制还需要进行大量的临床前研究。随着对MANF的进一步研究，未来可能会为CIRI等神经系统性疾病的发病机制和防治方法提供新方向。