发现患者和肿瘤类型间共有新抗原的HLA-新表位

精肿瘤免疫疗法的广泛应用受到患者或肿瘤类型中常见的有效新表位数量的限制。为了扩大已知的共享新抗原-HLA复合体库，开发了一个高通量平台，将体外多肽-HLA结合分析与表达单个HLA等位基因的工程细胞模型相结合，并结合含有47种常见肿瘤新抗原的串联转基因。从24000多个可能的新表位-HLA组合中，生化和计算评估产生了844个独特的候选，其中86个是在对工程的单等位基因细胞系进行免疫沉淀质谱分析后得到验证的。为了评估免疫原性的可能性，鉴定了识别特定新表位-HLA对的TCR，并在引入人T细胞后引发反应。这些细胞系统和关于治疗相关的新表位在其HLA背景下的数据将帮助研究人员研究抗原加工以及新表位靶向治疗。

这里提出了一个可扩展的新表位-HLA对发现的pipeline。选择了47个癌症突变和15个流行的HLA等位基因来定义新表位，进而确定假定的临床靶点。采用高通量的HLA结合分析和NetMHCpan4.0通过实验和计算确定新表位-HLA的组合，以供后续研究。用这两种方法观察到的新表位-HLA对，用非靶向和靶向质谱(MS)对经修饰的HLA单等位基因细胞系进行呈递分析，得到86个新表位-HLA对。为了评估这些靶点的治疗潜力，使用了通过TCR抗原多重鉴定(MIRA)鉴定发现的TCR，并证明了突变选择性T细胞靶向表达这些新表位的细胞。

共有肿瘤新抗原的临床基因组学分析

为了建立新表位-HLA发现的计算和实验pipeline，首先在肿瘤和正常组织样本的测序数据中确定了癌症类型中常见的复发点突变。这得到了36个共有的肿瘤新抗原。接下来，挖掘等位基因频率网络数据库(AFND)和癌症基因组图谱(TCGA)来分类常见的单倍型，缩小到TCGA中携带者频率至少为10%，AFND中等位基因频率至少为5%的单倍型。这一分析得到了16个HLA等位基因，这些等位基因与36个选定的新抗原相结合，为平台的开发提供了基础。

新表位-HLA的高通量TR-FRET分析

为研究候选肿瘤新抗原和选定HLA等位基因之间的所有潜在新表位，建立了一种基于肽介导的条件性HLA复合体稳定的高通量时间分辨荧光能量转移(TR-FRET)分析方法。新抗原靶点集由上述36个共享的肿瘤新抗原和另外11个肿瘤抗原组成。另外，16个优先考虑的HLA中有15个在条件HLA复合体形式下是可行的。总而言之，这使得在消除重叠的肿瘤新表位以及由于合成挑战而产生的一个等位基因后，能够表征24149个新表位-HLA复合物。

预先负载紫外线(UV)可裂解多肽的条件性HLA复合体与感兴趣的新表位以100倍摩尔过量孵育，并在UV下暴露25min。这个反应导致条件配体断裂和肽从稳定的高亲和力的‘结合剂’转变为不稳定的结合剂，它从HLA的沟槽中解离。在有结合的新表位存在的情况下，肽交换将稳定HLA复合体，而缺乏结合会导致复合体解离。通过与anti-β2M抗体偶联的TR-FRET供体(Eu)和与链霉亲和素偶联的TR-FRET受体的荧光来监测络合物的稳定性，链霉亲和素与HLAα链上的生物素标记结合，其中只有当复合体保持完整时才能观察到TR-FRET信号。基于相对荧光单位(RFU)的比率对TR-FRET信号进行量化，并对信号进行双重归一化以生成稳健的Z分数(RZ-Score)。任何新表位-HLA与RZ-Score≥5的结合都被认为是“稳定的结合”，这是基于阳性对照CMV-peptide/HLA-A*02:01复合物的先前评估的保守措施。Z-Score≥5捕获了90%的阳性对照结合事件，而没有识别假阳性结合蛋白。

为了更好地理解TR-FRET结果与计算预测方法的比较，使用了NetMHCpan4.0。考虑了NetMHC结合亲和力(BA) %Rank相对于TR-FRET结果和洗脱配体(EL)%Rank来确定是否预测到新的表位出现(%Rank≤2)。KRAS G12V与A*03:01结合的代表性数据显示，先前描述的两个新表位VVGAVGVGK和VVVGAVGVGK，作为两种方法的结合体(图1d)。对新抗原-HLA组合的进一步检查显示，TR-FRET和NetMHC结果之间有可变的一致性。用C*08:02对KRAS G12D多肽的评估发现，已知的新表位(GADGVGKSAL)是这两种方法的结合体。

当测量所有潜在的新表位-HLA复合体的百分比时，TR-FRET通常比NetMHC识别出更稳定的结合。当对结合体进行分类时，NetMHC预测和TR-FRET之间的一致性一般不到30%，而只有在非结合体的情况下才发现更强的一致性。为了进一步比较，绘制了所有候选新表位-HLA的TR-FRET RZ-Score和NetMHC %Rank，表明两种方法都有0.63%的新表位-HLA对是可能的结合体。不同的方法确定了新表位-HLA的额外结合事件的相似百分比，表明每一种方法都有可能发现独特的结合组合。这些发现突显了高通量TR-FRET分析相对于计算预测识别的扩展和互补的新表位-HLA对的能力，并表明为了全面发现新表位，需要两种方法的共同部署。

构建共表达47种新抗原的单等位基因细胞

尽管在体外观察到多肽-HLA的稳定性或相互作用的计算预测，突变蛋白的表达和加工可能不会导致在细胞环境中呈现新的表位。因此，候选新表位的验证通常需要通过HLA免疫沉淀(HLA-IP)和MS与表面结合的HLA直接物理关联的证据。这一过程通过使用工程化的“HLA单等位基因”细胞系得到加强，尽管这些细胞系在很大程度上依赖于内源性突变蛋白的表达或相对较少的突变转基因的表达，从而限制了通量。

在单个HLA-null细胞系中共表达所有47个候选新抗原序列(以突变位置为中心的~25个氨基酸片段)将提高单等位细胞系生成的通量，并随后通过靶向MS验证TR-FRET/NetMHC鉴定的新表位-HLA对。为此，选择了缺乏HLA-A和HLA-B的HMy2.C1R(C1R)淋巴母细胞系。为了产生一个完整的C1R-HLAnull细胞系，用CRISPR-Cas9破坏了HLA-C等位基因(HLA-C*04:01)，并用FACS富集HLA缺失群体。

局部氨基酸序列背景可能会影响抗原的处理。因此，设计了独特的C1R-HLAnull以稳定表达所有47种优先考虑的新抗原的串联，这些新抗原是否被短的而灵活的氨基酸接头分离。随后，通过稳定的慢病毒转导有接头和无接头新抗原表达的C1R-HLAnull细胞系，将15个HLA等位基因作为单个转基因引入，产生了30个细胞群。为了验证多抗原盒的功能，有接头和无接头新抗原构建体包含一组相同的七个已知的HLA-A*02:01呈递表位。HLA-IP随后的靶向MS分析证实，在有接头和非接头的HLA-A*02:01工程细胞中都存在两个对照肽和先前描述的TP53 R175H新表位。

检测工程化单等位基因细胞新表位

靶向和非靶向MS均应用于单等位细胞系的新表位发现。非靶向MS分析能够无偏见地从整个免疫肽组中识别多肽，而靶向分析有助于检测每个细胞拷贝数较低的多肽，但仅限于TR-FRET/NetMHC分析中的优先序列。

用半自动工作流程进行非靶向MS分析，从每个细胞群中鉴定出218-6663个独特的8-11-mer肽。无论多抗原接头状态如何，8-11-mer多肽的数量和每个等位基因的一般序列特征都是重叠的，并确认所提供的多肽符合已知基序。通过检测来自A*02:01和A*11:01单等位细胞的对照病毒表位以及来自8个不同HLA等位基因的整合蓝色荧光蛋白(BFP)选择标记的表位，证实了多抗原盒的表达。

从非靶向分析中，观察到22个HLA-新表位和几个来自多抗原非突变携带区域的多肽。新表位对应于5个HLA上15个共享新抗原，占NetMHC预测的新表位-HLA对的~5.4%，占TR-FRET确定的新表位-HLA对的~3.7%。在22个新表位-HLA对中，有10个是以前在文献中描述的，其余12个是基于对Tantigen、CAatlas和Nedb的搜索和扩展的文献调查而被认为是新的。TR-FRET和NetMHC对所有22个识别的配对都显示出极好的一致性；17个被两种方法鉴定为结合体。1对和3对新表位-HLA分别被TR-FRET和NetMHC地鉴定为命中，表明每种方法都可以预测不同的新表位亚群。1对新表位-HLA(TP53 R175H(HMTEVVRHC)/A*02:01)代表例外，TR-FRET RZ-Score为3.9，NetMHC EL %Rank为3.98，这两种方法都不被认为是成功的，这表明假阴性仍然可能存在。

虽然靶向MS分析将改进对呈现的新表位的检测，但这依赖于重同位素标记的标准多肽。因此，需要对1786个多肽(47个新抗原×38个可能带有突变的候选新表位) 的逻辑上具有挑战性的合成，以从单等位细胞系中筛选所有潜在的新表位。因此，以TR-FRET结果作为初步筛选，合成了全部397个具有RZ-Score≥5的多肽。由于TR-FRET和NetMHC结果的互补性，又合成了81个RZ-Score<5，Net MHC %Rank≤2的多肽。这479个多肽被分为15个等位基因特异库，包括21-88个多肽。

靶向MS分析确定了12个不同等位基因和36个新抗原的86个新表位-HLA对，与非靶向MS分析相比，改进了~4倍。在检索文献和相关数据库后，确定21个新表位-HLA对以前被描述过，65个是新的。通过非靶向和靶向分析确定的86个新表位-HLA对中有20个与A*11:01相关。这可能是因为在多抗原盒中存在8个不同的KRAS新抗原序列，其中14个A*11:01特异的新表位和14个A*03:01特异的新表位被映射到KRAS G12X或G13X新抗原。

为了评估使用TR-FRET和NetMHC结果为靶向MS选择多肽的价值，为观察到的86个新表位-HLA对中的每一个绘制了RZ-Score与NetMHC %Rank的图。这表明，55个新表位是由TR-FRET稳定结合的，并预测将由NetMHC提出。13对新表位-HLA仅在TR-FRET中被发现为命中，而18对新表位-HLA仅在NetMHC中被发现为命中。为了了解仅通过靶向分析确定的新表位-HLA对的结合特征，绘制了在非靶向分析和靶向分析中观察到的多肽与仅在靶向分析中发现的多肽相比的RZ和NetMHC %Rank分数。与非靶向分析中检测到的新表位相比，仅通过靶向分析确定的新表位-HLA的NetMHC %Rank和TR-FRET RZ-Score范围更广。这表明，靶向分析可以识别出与非靶向观察到的新表位相比，结合较弱的新表位。

靶向MS允许对新表位的肽呈递进行定量。总体而言，测得的新表位呈递的量从60amol到2.5pmol，并且在细胞系生长和样品制备的独立重复中是一致的。用非靶向MS检测到的两个肽，EGFR G719A(ASGAFGTVYK)和FGFR3 S249C(ERCPHRPIL)显示出高的量。当检测到的新表位的量与每个等位基因的RZ-Score、NetMHC EL%Rank或NetMHC BA%Rank进行比较时，没有发现明显的相关性。这表明每个评分对新抗原的呈递都有预测价值，但也不能用来估计呈递的量。

多抗原盒设计影响新表位呈递

多抗原序列包括具有已知A*02:01结合表位的新抗原，以确认盒的翻译、加工和呈递。这种对照有可能与实验中的新表位竞争，从而为假阴性创造途径。为了评估这一点，建立了一个单独的A*02:01细胞系，该细胞系稳定表达一个没有对照序列的非接头多抗原盒。通过对非对照线的分析，检测到另外两个新表位：YVCNTARA(SF3B1 R625C；RZ-Score=16；EL%Rank=5.3)和QLMPFGSLL(EGFR C797S；RZ-Score=7；EL%Rank=0.21)(，带“X”正方形)。这些结果表明，强结合多肽可以抑制某些新表位的呈递，修改后的工作流程可能会省略多抗原盒的对照序列。

在设计肿瘤疫苗时，多抗原盒的长度是一个重要的考虑因素，考虑到盒的C末端/3‘端的新抗原的翻译将会减少，这可能已经考虑到在临床中使用较短的盒(例如，10-mer或34-mer)