脑微透析探针置入对透析样品的影响

【摘要】 目的 探讨微透析探针置入的刺激对大鼠纹状体内谷氨酸水平的影响。 方法 通过初次和二次置入微透析探针至大鼠纹状体并收集脑微透析液,结合高效液相色谱法检测透析液谷氨酸水平。 结果 探针初次置入纹状体谷氨酸水平立即升高约30倍,3 h后降至基础值;二次置入时谷氨酸仅升高约15倍,1 h后即降至基础值。 结论 微透析探针置入的刺激可引起大鼠纹状体内谷氨酸水平短暂增高,在脑微透析检测谷氨酸样品时应注意探针置入的影响。

【关键词】 脑; 微透析; 谷氨酸; 高效液相色谱


ABSTRACT: ob[x]jective To investigate the influence of glutamate levels in rat striatum after intracerebral implantation of microdialysis probe. Methods Microdialysis probe was inserted into rat striatum by one-time or two-time insertions. Dialysate was collected and detected for glutamate levels with high performance liquid chromatograph(HPLC). Results The insertion of microdialysis probe into striatum at first time results in a transient raise in glutamate(about 30-fold above ba[x]seline), and declined to ba[x]seline within 3 hours. While glutamate levels were increased only 15-fold above ba[x]seline when microdialysis probe reinsert into striatum, and dropped to ba[x]seline within 1 hour. Conclusion The data suggest that the implant trauma may cause transient glutamate perturbations in rat striatum. Thus, the influence of probe implantation for detecting glutamate samples by intracerebral microdialysis need to be considered.

KEY WORDS: brain; microdialysis; glutamic acid; chromatography,high performance liquid

脑微透析技术是一种脑内生物化学物质活体取样方法,其原理是将具有半透膜作用的探针置于生物体特定脑区,以恒定速度通过探针灌注与组织液成分相近的等渗灌流液,当灌流液流经探针前端透析膜时,位于膜外侧的组织内较小分子质量生物活性物质将顺浓度梯度从膜外扩散入膜内,并随灌流液被引流出探针外。以一定的时间间隔收集微透析液,并采用高灵敏度化学检测系统连续检测透析液中待测生物活性物质浓度,可监测活体动物或人体特定脑区细胞外生物活性物质浓度随时间改变的动态变化。

虽然脑微透析术是一种微创技术,但置入体积较单个细胞及细胞间隙均相对大的探针至靶组织,必然会引起邻近部位的生物化学、生理学及组织学改变,例如局部血流量增加、组织水肿,细胞死亡、神经胶质增生、出血等［1-2］,这些变化可在一定程度及一定时间引起邻近神经组织递质释放量的异常增加或减少,从而使透析液中待测物质浓度不能真实反映脑内的正常情况。因此合理使用微透析探针以减少探针置入刺激对神经递质水平的影响,并选择尽可能接近脑内真实的透析液结果,是该技术应用中亟待解决的问题之一。笔者以检测大鼠纹状体内神经递质谷氨酸为例,通过对同一只大鼠纹状体内初次/二次置入微透析探针,并即时收集脑微透析液,结合在线高效液相色谱分析,检测透析液中谷氨酸水平,探讨不同探针置入条件对微透析样品中待测物质浓度及样品收集时间的影响,为微透析探针的合理使用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级Sprague-Dawley大鼠10只,雄性,体质量(180±10)g,由上海斯莱克实验动物有限公司提供［合格证号:SCXK(沪)2007-0005］。

1.1.2 仪器 脑立体定位仪(日本Narishige公司);微透析探针(O.D.0.5 mm,膜长4 mm)及脑微透析系统(美国CMA公司);高效液相色谱分析仪(美国Waters公司);Nova-Pak C18反相色谱层析柱(150 mm×3.9 mm,粒径5 μm,美国Waters公司)。

1.1.3 试剂 谷氨酸(Glutamate)、硼酸钠(Na2B4O7)、邻苯二甲醛(O-Phthaldialdehyde)、β-巯基乙醇、EDTA(美国Sigma公司);甲醇(德国Merck公司,HPLC级色谱纯);氯胺酮、流动相试剂等均为国产分析纯;实验用水为Millipore超纯水。

1.2 方法

1.2.1 样品收集 大鼠麻醉后,将其头部固定在脑立体定位仪上,根据大鼠脑立体定位图谱［4］置入微透析引导管至右侧纹状体(以SD大鼠,LB 9.0 mm,前囟标准AP+1.0 mm,ML-2.5 mm,DV+4.0 mm进行标化)。

1.2.1.1 探针初次置入 动物静养3 d后,将引导管内芯拔出,置入微透析探针,以2 μL/min灌注Kreb’s-Ringers液(140 mmol/L NaCl,4 mmol/L KCl,1.2 mmol/L CaCl2,1 mmol/L MgCl2,pH 7.4),从置入当时(0 h)开始,每隔1 h收集1管脑微透析液至5 h,待收集完毕以0.2 μL/min维持,24 h后再以2 μL/min收集脑微透析液3管,结束实验;探针拔出,置灭菌废弃微透析探针,动物回笼静养。

1.2.1.2 探针二次置入 动物继续静养3 d后,将引导管内的废弃微透析探针拔出,重新置入新探针,以2 μL/min灌注Kreb’s-Ringers液,分别收集0～5 h及24 h后脑微透析液(过程同1.2.1.1),每管透析液收集10 min。

1.2.2 色谱分析 用邻苯二甲醛(OPA)进行谷氨酸的柱前衍生,以单泵恒流洗脱,流速0.9 mL/min,柱温30 ℃,流动相为:0.1 mol/L磷酸氢二钠,1 mmol/L EDTA和25%甲醇,pH 6.4;荧光检测器激发波长330 nm,发射波长420 nm。取微透析样品中某一成分峰保留时间与标准溶液相应峰的保留时间一致者作为该样品的谷氨酸峰。

1.2.3 探针回收率测定 新探针激活后置于谷氨酸标准液(0.1 mmol/L)中,以2 μL/min持续灌注Kreb’s-Ringers液,平衡1 h后收集体外透析液3管。取HPLC检测体外透析样品谷氨酸平均峰面积(Am)与标准液谷氨酸峰面积(As),计算各探针的相对回收率:

R＝Am/As×

1.3 统计学处理 新探针回收率及谷氨酸检测值占基础值的百分比视为记量资料,以x±s表示,全部数据以SPSS 13.0 软件统计分析。

2 结 果

2.1 新探针体外相对回收率 各新探针体外相对回收率为(22.36±4.48)％。

2.2 HPLC检测谷氨酸色谱图 以探针置入大鼠纹状体24 h后安静时为基础状态，测得谷氨酸基础值约为3 μmol/L(n＝10)(图1)。

图1 高效液相色谱检测纹状体透析液中谷氨酸基础值

Fig 1 HPLC trace of a basal striatal dialysate sample showing the presence of glutamate

2.3 纹状体内谷氨酸随探针置入时间的变化 探针初次置入时谷氨酸立即较基础值增高约30倍,经3 h降至基础水平;二次置入时增高约15倍,1 h后降至基础水平(图2)。 n=10. 以谷氨酸达到平稳状态为基础值,谷氨酸变化以占基础值的百分比表示.
图2 初次/二次探针置入时大鼠纹状体内谷氨酸的变化

Fig 2 The variation of glutamate levels after primary and secondary probe implantation

3 讨 论

3.1 脑微透析技术面临的问题 脑微透析术作为检测细胞外间隙神经递质浓度的方法,近年来发展十分迅速,但同时也伴随着各种问题。该技术应用的前提是透析出的细胞外物质浓度能较为准确地反映脑内细胞外间隙的物质水平,但由于探针回收率变化等原因,实际透析液中待测化学物质的浓度仅代表其在脑内细胞外间隙部分的水平;而脑微透析术的优点之一是可以长时间动态观察脑内神经递质变化,但微透析探针的置入对脑组织有一定的刺激,反复插拔探针可多次刺激脑组织,持续留置探针(≥3 d)也易引起各种组织生化反应,例如探针置入部位周围可出现肥大星形胶质细胞的浸润［2,5］,并且这些聚集在探针前端透析膜外的神经胶质细胞增生可产生非多肽类分子的扩散屏障,减弱周围神经元的化学反应［2］;同时机体血脑屏障的通透性在探针置入后也可能增高［3,6］;灌流液中某些离子浓度改变亦可使脑内神经递质释放量增加或减少,这些因素都可能影响透析结果对脑内真实情况的解释。Horn等人在权衡多方面因素后认为,探针长期留置脑内可避免探针反复置入对脑组织的多重刺激,有利于实验结果的稳定［7］。Rey-nolds等建议采用在每天微透析结束时将探针拔出，次日重新插入的方法,以避免慢性脑微透析所产生星形胶质细胞突起伸入探针透析膜的现象以及炎症反应［8］。目前一般建议在探针置入8～12 h后开始进行实验及样品收集。

3.2 脑微透析技术改良之处 在实验前对所用探针进行体外相对回收率测定,以确保后续实验数据的可比性。通过对探针初次置入与二次置入的比较,提示微透析探针置入刺激可引起大鼠纹状体内神经递质谷氨酸水平的短暂增高,且随置入条件的不同引起递质水平增高的程度及恢复的时间也不同。因此,在以脑微透析技术检测脑内神经递质样品时应特别注意排除探针置入的影响,尤其是对于因检测时间短、间隔期长而采用探针间隔置入方法的慢性脑微透析实验时,建议适时收集透析液:收集时间至少在探针初次置入后3 h,二次(或后续)置入后1 h。另外需特别指出的是,考虑到引导管内芯与微透析探针之间有前端透析膜长度的差别,建议采用废弃的微透析探针作为两次置入探针间期的过渡,以尽量降低探针替换过程中对脑组织的多次损伤。

要分析脑内一种神经递质的细胞外浓度,不仅受到神经元突触末梢释放的影响,还受到酶降解、递质扩散和再摄取等诸多方面的影响,是个极为复杂的生物化学过程,而在脑微透析过程中探针置入的刺激、样品收集的时间、动物的个体差异等也都会影响样品的检测结果。因此,要得到更加真实、确切的脑内相关资料,首先应建立稳定的脑微透析方法,本研究结果可为脑微透析实验的相关研究提供参考。

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