全反式维甲酸对宫颈癌细胞的生物学作用

作者：胡海燕,杨尚武,徐瑾　　作者单位：南方医科大学附属深圳妇幼保健院，广东 深圳

　　【摘要】 目的：探讨全反式维甲酸(alltransretinoic acid, ATRA)宫颈癌HeLa细胞增殖与分化的影响及其作用途径。方法：用MTT法检测ATRA作用下HeLa细胞增殖，电镜下观察细胞超微结构，集落形成实验观察集落形成能力，流式细胞术检测细胞周期，半定量RTPCR检测cmyc mRNA水平变化。结果：ATRA能抑制HeLa细胞增殖，诱导分化，降低cmyc mRNA的水平。结论：ATRA对宫颈癌HeLa细胞的生物学作用是多方面的。

　　【关键词】 宫颈肿瘤;Hela细胞;细胞分化;维甲酸;流式细胞术;四甲基偶氮唑盐比色法

　　Biological effects of all transretinoic acid on cervix carcinoma cell HU Haiyan, YANG Shangwu, XU Jing (The Affiliated Shenzhen Maternity and Child Healthcare Hospital of Nanfang Medical University, Shenzhen 518000,China)

　　[ABSTRACT] ob[x]jective: To investigate the role of all-trans-retinoic acid (ATRA) on inhibiting proliferation and inducing differentiation in Hela cells and illustrate its mechanism. Methods: The Hela cell proliferation was studied with MTT assay after treatment of ATRA. The ultramicrostructures of the cells were observed by electron microscope and the efficiency of colony formation was studied by colony formation test. The cell cycles were analyzed by flow cytometry and the changes of c-myc mRNA levels were determined by semiquantitative RT-PCR. Results: ATRA could significantly inhibit proliferation，induce differentiation and decrease the level of c-myc mRNA. Conclusion: The biological effects of all trans-retinoic acid on Hela cell are multiple.

　　[KEY WORDS] Cervix tumor; Hela cell; Cell differentiation; Retinoic acid; Flow cytometry; MTT

　　维甲酸是维生素A的一种高活性衍生物，可诱导某些肿瘤细胞终末分化，成为正常或接近正常的细胞，从而达到治疗目的[1]。本实验通过观察全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid， ATRA)对宫颈癌HeLa细胞增增、分化及癌基因的影响，探讨维甲酸对宫颈癌细胞的作用途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人宫颈癌细胞株HeLa由武汉大学中南医院肿瘤研究所提供。ATRA为Sigma公司产品，溶于二甲基亚砜(DMSO)中。MTT、RNase、PI购自Sigma公司。SV总RNA分离试剂盒购自Promega公司。一步RTPCR试剂盒购自TaRaKa公司。PE2400型PCR循环仪为美国Perk-elmer公司产品。

　　1.2 引物

　　扩增产物大小：cmyc 250 bp，βactin 600 bp。引物序列分别为：

　　cmyc上游 5′-CTCTCAACGACAGCAGCCCG-3′

　　下游5′-AGGTGATCCAGACTCTGACC-3′

　　βactin上游5′-CGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACC-3′

　　下游5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACG

　　ATG-3′

　　1.3 方法

　　1.3.1 细胞培养 HeLa细胞培养于含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，置37 ℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养，每48 h换液1次。取对数生长期细胞进行实验。实验分为两组：①ATRA实验组，1640培养液中加入ATRA，终浓度为10-6 mol•L-1(DMSO<0.1%);②对照组，加入相应量的DMSO。

　　1.3.2 细胞生长曲线测定 培养瓶中接种105个•mL-1细胞，分两组(按上述方法分组)，连续培养7 d，每日计数。以细胞数作纵坐标，时间为横坐标，作生长曲线。

　　1.3.3 MTT法检测细胞生长抑制率 在96孔培养板上接种细胞，每孔2×104个细胞，加入不同浓度ATRA(1×10-7mol•L-1, 5×10-7mol•L-1, 1×10-6mol•L-1, 5×10-6mol•L-1, 1×10-5mol•L-1)，对照组加入相应量的培养液，每组设6个复孔，完全培养液为空白对照，培养72 h后去培养液，每孔加新鲜配制的MTT液(MTT/PBS，5 μg/mL)10 μL，37 ℃ 5%CO2继续培养4 h，弃上清液，每孔加DMSO100 μL，振荡10 min，用酶联仪测570 nm处的吸光度(A)值。计算抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×。按t检验进行数据统计。

　　1.3.4 透射电镜观察细胞超微结构 收集培养7 d后的实验组细胞、对照组细胞，1 000 r/min离心10 min后取细胞团。用3%戊二醛、1%锇酸双固定，经包埋切片处理后，醋酸铅和枸橼酸铀双重染色，在H-600型透射电镜下观察细胞超微结构并照相。

　　1.3.5 流式细胞仪(FCM)分析细胞周期 用胰酶将1×10-6 mol•L-1ATRA分别作用3 d、7 d的细胞及对照组细胞消化成单细胞悬液，预冷的70%乙醇固定后4 ℃保存。测定前去固定液，加RNA酶作用30 min，再加PI染色液(含PI 100 μg•mL-1)4 ℃避光染色30 min，300目过滤网过滤后上机检测。每个样本测10 000个细胞，数据经计算机处理分析得出细胞周期各时相比例。实验结果用χ2检验统计。

　　1.3.6 平板集落形成实验 24孔板每孔加100个细胞，细胞贴壁后，加入不同浓度的ATRA(10-7 mol•L-1，10-6 mol•L-1，10-5 mol•L-1)，培养7 d后甲醇固定，Giemsa染色，倒置显微镜下计数每孔≥50个细胞的集落数。计算集落形成率=(对照组集落数-实验组集落数)/对照组集落数。实验结果用t检验统计。

　　1.3.7 半定量RT-PCR分析 收集1×10-6mol/L ATRA分别作用3 d、7 d的细胞及对照组细胞，按Promega公司提供的SV总RNA分离试剂盒说明提取RNA，选用TaRaKa公司的一步RTPCR试剂盒，将反应混合物置于DNA扩增仪中，42 ℃逆转录60 min，95 ℃预变性5 min，再进行PCR循环(95 ℃ 1 min→56 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min)共30个循环，后72 ℃　7 min延伸。PCR产物用2%琼脂糖电泳，紫外灯下检测。结果采用HPIAS2000型图像分析系统扫描定量，以βactin基因作为内参照，测定cmyc mRNA的相对表达量。

　　2 结果

　　2.1 ATRA对细胞生长曲线的影响

　　在浓度为10-6mol•L-1ATRA的连续作用下，HeLa细胞增殖逐渐被抑制，生长速度明显减慢。连续作用7 d后，细胞增殖抑制率达到48.2%。经台盼蓝染色，各组均未见明显死亡细胞，提示维甲酸这一作用为非细胞毒抑制作用。

　　2.2 MTT法测定细胞生长抑制率

　　用不同浓度的ATRA(1×10-7mol•L-1, 5×10-7mol•L-1, 1×10-6mol•L-1, 5×10-6mol•L-1, 1×10-5 mol•L-1)处理HeLa细胞，结果表明， RA的浓度在10-7mol•L-1时即呈现出明显抑制作用，与对照组相比有显著性差异(P<0.01)，且随着浓度增加，抑制效应增强，高抑制率为26.94%。HeLa细胞生长抑制率注：* VS 对照组吸光度，P<0.01。

　　2.3 ATRA对HeLa细胞超微结构的影响

　　透射电镜下，对照组细胞体积大、呈圆形、卵圆形或不规则形，细胞核大、不规则，核周有凹陷性切迹，常染色质发达，有2～3个核仁，胞浆丰富。实验组细胞体积缩小、呈圆形或卵圆形，核小、核形趋于规则，异染色质增多，核仁减少甚至消失，胞浆内出现发育良好的线粒体、高尔基复合体等细胞器。 海南医学院学报 Vol.14 No.1 Feb.2008 ATRA对Hela细胞生长的影响图2 ATRA诱导前HeLa细胞的超微结构(×5 000)ATRA诱导前HeLa细胞的超微结构(×6 000)

　　ATRA诱导后HeLa细胞的超微结构(×8 000)ATRA诱导后HeLa细胞的超微结构(×30 000)注：a. marker;b. 对照组;c. RA1组：1×10-6mol•L-1ATRA作用3 d;d. RA2组：1×10-6mol•L-1ATRA作用7 d。

　　c-myc 基因RT-PCR扩增片段电泳结果

　　2.4 ATRA对细胞周期的影响

　　与对照组相比，10-6 mol•L-1ATRA处理3 d后细胞周期分布发生明显变化，主要表现在G1/G0期细胞堆积，S期细胞减少。作用时间延长至7 d，G1/G0期细胞比例逐步增高，S期细胞同时减少。提示RA能阻止G1/G0期细胞向S期细胞转化过程。

　　2.5 平板集落形成实验

　　实验各组均有集落形成，10-7～10-5mol•L-1RA可显著降低HeLa细胞的集落形成能力。随着ATRA作用浓度的加大，HeLa细胞集落形成数逐渐减少，与对照组相比均有显著性差异(P<0.01)。 HeLa细胞周期分布 集落形成实验结果注:*VS对照组P<0.01

　　2.6 cmyc 基因RTPCR扩增片段的电泳结果

　　实验各组均可见2条带：250 bp的cmyc 和600 bp的βactin(内标)基因片段。经ATRA分别作用3 d、7 d后，HeLa细胞cmyc mRNA表达减少。

　　2.7 cmyc基因RTPCR扩增片段的定量扫描结果

　　HeLa细胞中癌基因cmyc mRNA 相对含量为0.570 2。经ATRA作用3 d后的HeLa 细胞，其cmyc mRNA相对含量为0.430 8，较对照组降低，且随着作用时间的延长，cmyc mRNA相对含量逐渐降低。这提示RA抑制了癌基因cmyc的表达。cmyc基因RTPCR扩增片段定量扫描结果注:RA1实验组：1×10-6mol•L-1ATRA作用3 d;RA2实验组：1×10-6mol•L-1ATRA作用7 d。[HJ3mm〗

　　3 讨论

　　全反式维甲酸是一种有效的诱导分化剂，在调控多种组织和细胞的形态发生、增殖、生长发育、代谢以及维持内环境稳定等方面具有广泛的生物学作用[2，3]。本实验通过观察ATRA处理前后HeLa细胞的增殖、细胞形态、细胞周期、集落形成能力及癌基因cmyc表达的变化，来阐述ATRA对宫颈癌细胞生物学行为的多途径影响。

　　从本实验中发现，适当浓度ATRA作用下，HeLa细胞增殖受抑制，并向正常细胞方向分化。细胞分化表现在形态和功能2个方面。形态分化是细胞分化的表型特征，也是基本特征，能客观反应分化诱导剂对细胞的诱导分化作用。透射电镜下观察发现，ATRA作用下的HeLa细胞趋向成熟分化，出现成熟细胞的特征。如细胞核质比例减小，核小且核仁减少，核内异染色质增多，胞质内出现线粒体、高尔基复合体等分化良好的细胞器。细胞无限快速增殖是恶性肿瘤细胞基本特征之一，而分化又与增殖呈拮抗状态，细胞增殖速度减慢常是细胞分化的结果。从HeLa细胞生长曲线可以看出，对照组细胞生长迅速，实验组生长曲线趋于平坦，细胞增殖受到抑制。10-6mol/LATRA作用7 d后，细胞增殖抑制率达到48.2%。本实验中观察到，在10-7～10-5mol/L浓度范围内的ATRA对HeLa细胞生长抑制作用逐渐增强，呈浓度依赖性。实验各组与对照组相比，有显著性差异(P<0.01)。实验组细胞经台盼蓝染色，未见死亡细胞，且流式细胞仪结果未见亚二倍体峰，这均说明维甲酸抑制HeLa细胞增殖的同时，未诱导细胞凋亡，而是诱导细胞成熟分化。集落形成实验是反映细胞良恶性程度的可靠指标。本实验发现10-7mol•L-1ATRA就可抑制HeLa细胞集落形成，随着维甲酸浓度递增，HeLa细胞集落形成率明显下降，提示ATRA使HeLa细胞生长的接触抑制及锚泊依赖性(anchor dependence)逐渐恢复，细胞功能趋于良性分化。这均说明ATRA能使宫颈癌HeLa细胞增殖速度减慢，从形态上、功能上诱导HeLa细胞分化成熟，逆转其恶性表型。这种作用呈现出时间剂量依赖性。

　　肿瘤细胞中癌基因过表达现象十分普遍。cmyc是一个“经典”的癌基因，其编码产物是一个与细胞增殖有关的核蛋白，在细胞增殖、分化调控中起重要作用[4]。本实验观察到ATRA下调了cmyc 基因转录水平。随着ATRA作用时间延长，细胞内cmyc mRNA水平逐渐下降，HeLa细胞出现成熟细胞的特征。已有学者从HeLa细胞中分离出cmyc基因内含子结合蛋白MIBP1(p160)和RFX1(p130)，MIBP1/RFX1DNA结合区的同向重复序列能抑制cmyc基因上游启动子活性。研究发现，ATRA作用后的细胞MIBP1、RFX1蛋白表达上调，且其DNA结合区域的抑制活性增强。故可认为，ATRA通过MIBP1/RFX1下调cmyc的表达是ATRA诱导宫颈癌细胞分化的分子机制之一。

　　细胞增殖、分化的DNA代谢是通过细胞周期实现的。G1/S关卡是细胞能否进入分裂周期以及细胞增殖能否顺利完成的重要调控点。本实验中流式细胞仪结果显示，ATRA使HeLa细胞集中阻滞在DNA合成静止期—G1期，而DNA合成活跃期—S期的细胞数减少。提示ATRA使肿瘤细胞阻滞在G1期，抑制细胞增殖，并诱导肿瘤细胞分化成熟。

　　宫颈癌的发病率在妇科肿瘤中占第1位，近年来呈上升趋势。手术及放化疗虽可控制肿瘤的发展，但有相当多的患者由于不能耐受手术、放化疗的不良反应而放弃治疗，终死于肿瘤并发症。本实验显示ATRA能显著降低宫颈癌HeLa细胞的恶性程度，诱导其成为正常或接近正常的细胞，并且ATRA对宫颈癌细胞恶性行为的抑制作用是多环节的。由此可见，ATRA是一种很有前景的治疗恶性肿瘤的药物。