CD133 阳性肝癌细胞周期分析

　　作者：王吉荣,张峰　　作者单位：江宁区中医院普通外科(南京 江苏 );南京医科大学附属医院肝脏外科(南京 江苏)

　　【摘要】 目的：免疫磁珠分选法分选肝癌细胞系SMMC7721 中CD133+细胞, 并检测CD133+和CD133-细胞周期。方法：采用免疫磁珠分选法分选肝癌细胞系SMMC7721 中CD133+和CD133-细胞, 乙醇固定，PI染色，流式细胞仪(FCM)检测细胞周期。结果：CD133+细胞在SMMC7721中所占比例为0.9%, FCM 检测显示SMMC7721 细胞株中CD133+细胞周期处于G0/G1 期的比例为85.3%，而CD133-细胞G0/G1 期的比例相对较低，为61.6%，未分选细胞居中，为68.9%。结论：人肝癌细胞系SMMC7721 中CD133+亚群,比例约为0.9%,且CD133+细胞多处于静止期,具有一般干细胞的特性。
　　c　　Analiysis of CD133 Pasitive Liver Cancer Cell Cycle　　Wang Jirong,et al　　Nanjing Jiangning District TCM Hospital(211100)　　Abstract：ob[x]jective：To identify CD133 positive cell in liver cancer cell lines SMMC7721 by magnetic cell sorting and analyze the cell cycle. Methods：CD133 positive and negative cells were sorted by magnetic cell sorting .Then the cell cycle was analyzed with PI in fluorescence-activated cell sorter.Results：The SMMC7721 liver cancer cells contained 0.9 % CD133 positive cells.The percentage of G0/G1cells was higher ( 85.3%) in CD133 positive cells than in CD133 negative cells( 61.6%).Conclusion：Liver cancer cell line SMMC7721 contains CD133 positive cells, and CD133 positive cells were quiescent like other stem cells.

　　Key words：CD133;SMMC7721;Cell cycle;Tumow stem cells

　　近年来的肿瘤干细胞学说认为，肿瘤组织中存在极少量的肿瘤干细胞，这些细胞具有无限增生的潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性作用。这一理论在白血病、乳腺癌、脑肿瘤中已得到证实[1-3]。CD133 是近年在干细胞领域研究较为活跃的细胞膜糖蛋白之一，常表达于未成熟的造血干细胞或祖细胞，在脑肿瘤、前列腺癌[4]、黑色素瘤[5]等恶性肿瘤细胞均有表达，被认为是这些肿瘤干细胞的标志之一。近的报道显示CD133 在肝癌细胞中也有表达，并且发现CD133+肝癌细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性。本文主要研究免疫磁珠分选法分选CD133+肝癌细胞，并进行细胞周期的检测，探讨CD133+细胞的生物学特性。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料

　　人肝癌细胞株SMMC7721 由江苏省人民医院肝脏外科实验室提供;DMEM 培养基、胰蛋白酶购自南京天为生物科技公司;胎牛血清由民海生物工程公司提供;流式细胞仪(美国BD 公司)，超净工作台、CO2恒温细胞培养箱(Jouan 公司)，离心机( HI-TACHI 公司)，37℃恒温水浴箱(Polysciences 公司);MACS 系统、CD133 分离试剂盒及CD133 抗体购置德国Miltenyi 公司。
　　1.2 细胞培养

　　SMMC7721 细胞生长在含10%热灭活胎牛牛血清、100u/ ml 青霉素及100ug/ml 链霉素的DMEM 培养基中，置于5%CO2、37℃恒温密闭式孵箱内培养传代。
　　1.3 CD133 阳性细胞分选
　　取对数生长期SMMC7721 和Bel-7402 细胞，细胞数量级达到1×107，PBS 冲洗两次，胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液，计数，离心(500g/min，10min)，吸除上清，350μL 缓冲液重悬;加入FC 受体100μL、抗CD133 免疫磁珠50μL, 4～8℃孵育10min;3.5mL 缓冲液重悬，离心，吸除上清，400μL 缓冲液重悬细胞，加入100μL 的anti-Biotin MicroBeads，4～8℃孵育15min;加3.5mL 缓冲液后离心，弃上清，将细胞重悬于500μL 缓冲液中，安装磁珠分选架和MS 柱, 500μL 缓冲液洗柱，待分选细胞上柱，500μL 缓冲液分三次洗柱;将MS 柱移出磁场,加1mL 的缓冲液洗柱，重复洗柱两次;所得CD133阳性细胞离心(1500r/min，5min)，培养液DMEM 重悬，取部分细胞用流式细胞仪检测CD133 的表达率。
　　1.4 细胞周期分析

　　取CD133+、CD133-及未分选细胞，制成单细胞悬液，以1200r/min离心10min，弃上清，PBS 洗涤，800 g/L 冰乙醇固定。弃去固定液，用预冷的PBS 缓冲液漂洗离心，使用10μL RNAseA(10g/L)处理后，加入荧光染料溴化丙锭溶液490μL，避光染色30min 后上流式细胞仪检测细胞周期。
　　2 结果

　　2.1 CD133 阳性细胞分选
　　流式细胞仪检测显示CD133+细胞在细胞株SMMC7721 中占0.9%，见图一A。免疫磁珠细胞分选、纯化SMMC7721 中CD133+细胞，流式细胞仪检测其纯度分别是89.2%，见图一B。图一A、B 显示免疫磁珠分选前后SMMC7721 细胞株中CD133+ 细胞数分别占0.9%、9.2%。
　　2.2 细胞周期分布

　　SMMC7721 细胞株中，刚分选的CD133+细胞多数处于静止期，G0/G1 期占85.3%;而CD133-细胞增殖期比例相对较高，S/G2/M 期细胞分别占38.4%，未分选细胞中S/G2/M 期细胞比例居中，占31.1%。
　　3 讨论

　　肿瘤干细胞学说认为：肿瘤组织中存在一小群细胞而非整个细胞群具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着重要作用，是肿瘤生长、转移和复发的根源, 这类细胞就是肿瘤干细胞。1997 年Bonnet[1]在血液系统肿瘤中首先证实了肿瘤干细胞的存在。近年来，随着干细胞分化抗原的研究进步、细胞表面特异性标志的确定以及流式细胞仪的广泛应用，实体肿瘤干细胞的相关研究也得到较大发展。目前在乳腺癌、脑肿瘤、结直肠癌中均发现了具有一定表型的肿瘤干细胞亚群。CD133 是一种相对分子质量为120kD，位于细胞膜表面具有5 个跨膜区的糖蛋白[6]，是干细胞的标志之一。肿瘤干细胞的概念提出后，研究者发现许多实体肿瘤肿瘤干细胞与CD133 抗原表达有关。Singh[3]等发现人脑肿瘤组织中CD133+肿瘤细胞具有较强的增殖和自我更新能力，在裸鼠皮下接种不到100 个细胞就可以形成新的肿瘤，新形成的肿瘤组织中的细胞构成和细胞分化状态与原发肿瘤一致，被认为是脑肿瘤起始细胞的特异性标志。此外在脑肿瘤，在前列腺癌[4]和喉癌[7]中，CD133 也被认为是肿瘤干细胞的标志之一。
　　肿瘤干细胞具有和干细胞相似的特性,干细胞是处于相对静止的一群细胞,具有慢周期的特点,小鼠表皮干细胞池的S-G2/ M 期细胞比例仅是非干细胞池的1/4[8] 。另外,小鼠角膜干细胞,毛囊干细胞也呈现慢周期的特点。干细胞的这种特点虽有利于防止体内未成熟细胞的消耗,可能是传统治疗无法杀灭肿瘤干细胞,成为复发转移的根源。我们在分离了SMMC7721 细胞的CD133+和CD133-细胞之后，检测细胞周期发现，新鲜分选的CD133+细胞中，多数细胞处于G0/G 期，S-G2 / M 期细胞占CD133+细胞14.7 %，而CD133-细胞中S-G2 / M期细胞占38.4 %，后者约是前者的2.6 倍，说明CD133+细胞也是慢周期细胞，具有干细胞的特征。肿瘤干细胞应该比正常干细胞有更强的存活或自我更新的潜能，二者在细胞周期方面的异同鲜见报道，近的研究显示,肿瘤干细胞和正常干细胞具有共同的自我更新机制，如Bmi-1 和β-catenin 途径,p16 和p19AFR 部分介导Bmi-1 在干细胞的细胞周期中的作用，CyclinD1 是β-catenin 的靶基因，细胞周期调控和自我更新机制有一定的联系，这方面也是本课题组今后所要研究的方向。