甲真菌病的组织病理诊断研究

孟悦　李若瑜　涂平　王端礼
　　【摘要】　目的　探讨组织病理学方法在甲真菌病诊断中的意义，了解甲真菌感染的超微结构。方法　对临床拟诊为甲真菌病的67例病甲分别采用直接镜检、真菌培养及组织病理学方法进行对比研究，同时选5例病甲做扫描电镜观察。结果　三种甲真菌检查方法的阳性率分别为67.2%、44.8%和82.1%，扫描电镜在3个甲面均检出真菌成分。结论　组织病理学方法较传统的真菌镜检和培养更为敏感(P均＜0.01)，两者结合可提高甲真菌病的正确诊断率。 　　

　　【关键词】　甲真菌病　　病理　　扫描电镜

Studies on histopathologic diagnosis of onychomycosis

Meng Yue　Li Ruoyu　Tu Ping
（Department of Dermatology,First Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034）
【Abstract】　ob[x]jective　To study the value of histopathologic examination in the diagnosis of onychomycosis and to find out the ultrastructural pattern of the fungi in infected nails.Methods　Sixty-seven cases suspected onychomycosis were examined with histopathologic method and compared with mycologic examinations.Affected nails from 5 patients were observed under scanning electron microscopy (SEM).Results　The positive rates of 3 methods were 67.2%,44.8%, 82.1% respectively.Fungal elements were seen in 3 parts of the affected nails under SEM.Conclusions　Histopathologic method has a higher positive rate than mycologic examination (P＜0.01) in diagnosis of onychomycosis and diagnostic accuracy can be increased with the combination of both methods.
　　【Key words】　Onychomycosis　　Histopathologic　　Scanning electron microscopy(SEM)

　　甲真菌病是由真菌感染甲板或甲下组织引起的疾病。传统的实验室诊断主要依靠直接镜检和真菌培养，但两种方法都存在一定的局限性［1］。为提高甲真菌病的正确诊断率，我们进行了甲真菌病的组织病理诊断及其与真菌学方法的对比研究，并通过扫描电镜观察了部分病甲的超微结构改变。
材料与方法
　　一、临床资料 　　门诊拟诊为甲真菌病、未经药物治疗的患者共67例，男36例，女31例；年龄21～70岁，平均46.3岁；病程3个月～40年，平均8.2年；趾甲真菌病49例，指甲真菌病18例；远端及侧端甲下甲真菌病(DLSO型)46例，全甲营养不良型甲真菌病(TDO型)21例；6例正常甲作为对照。 　　

　　二、方法 　　1.取材方法：DLSO及TDO型均采用远端修剪法取材。使用特制剪刀消毒后自甲板远端剪取甲组织，其宽度≥2mm，送病理检查，并取甲下碎屑做直接镜检和真菌培养；选择5例真菌学及病理检查均阳性的标本做扫描电镜观察。 　　2.实验方法：直接镜检按常规KOH法进行；真菌培养使用2管沙氏琼脂培养基(含放线菌酮和不含放线菌酮)，26℃培养3～4周，常规鉴定菌种，酵母菌采用API系统鉴定，如有霉菌生长，1周后重复取材培养，3次均为同一菌种生长则为阳性；组织病理：将标本固定于10%福尔马林溶液24小时，用30%硝酸溶液软化3～5天，石蜡包埋，制成4～6μm薄片，连续切片4～8张，PAS染色，光镜下观察；取红色毛癣菌感染的病甲4例，须癣毛癣菌感染的病甲1例，将甲的背面、横断面及腹面分别固定于标本台上，经临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。
结　　果
　　一、真菌学检查 　　67例标本中，直接镜检阳性45例(67.2%)，真菌培养阳性30例(44.8%)，分离出红色毛癣菌25例，须癣毛癣菌2例，近平滑念珠菌3例。 　　

　　二、组织病理 　　67例标本中，PAS染色阳性的菌丝50例；菌丝+孢子3例；小圆形芽生孢子2例，共55例，其阳性率为82.1%，与直接镜检和真菌培养法比较均有显著性差异(P均＜0.01)。其中9例(13.4%)直接镜检及培养均阴性者PAS染色阳性，12例PAS染色阴性的菌丝和孢子标本中，11例直接镜检和培养也阴性，有1例镜检阳性的标本其培养及组织病理学检查为阴性。 　　67例标本在光镜下观察均有程度不等的甲板增厚，53例角质细胞排列疏松，形成大小不等的裂隙，52例见细长、规则、有分支的菌丝和(或)关节孢子，提示为皮肤癣菌；2例可见圆形小细胞成团分布于甲板腹侧，并见芽生孢子，提示为酵母菌；还有1例培养为近平滑念珠菌的标本，组织病理表现为散在的圆形孢子和形态不典型的菌丝，有待免疫组化进一步明确菌种。 　　PAS染色与真菌培养结果对比显示：红色毛癣菌多侵犯甲板中下层，菌丝走行多与角质纤维平行，也可斜行或纵行；近平滑念珠菌常位于甲板腹侧，一般见不到假菌丝。 　　

　　三、扫描电镜 　　5例病甲的3个甲面均见程度不等的破坏，并见穿入角质层内及穿行于角质细胞中的菌丝，以及表面光滑的孢子。
讨　　论
　　甲真菌病传统的诊断主要根据临床表现、直接镜检和真菌培养，其主要的临床特征包括：甲下角化过度、甲剥离及色泽改变等。许多疾病如银屑病、扁平苔藓、湿疹等均可产生类似的甲改变，而由真菌引起的甲损害占全部甲病的50%［2］，因此仅靠临床表现来诊断甲真菌病是不可靠的。尽管直接镜检和真菌培养是甲真菌病实验室诊断的金标准［3］，但前者常由于标本中菌丝量过少，造成假阴性结果，且培养的成功与否又受到多种因素影响，其中能否取到有活性的真菌是其关键。DLSO型是临床常见的类型，真菌从甲游离端侵入后，逐渐向甲近端发展，因此在甲远端获取的标本其菌丝常缺乏活性［4］，本实验中的部分阴性结果可能与此有关。甲真菌病直接镜检结合真菌培养所达到的正确诊断率只有50%～70%［5］，同时应用组织病理学检查可以弥补这些不足。本实验结果表明：组织病理学方法较传统真菌学检查方法具有更高的阳性率，两者互补可提高甲真菌病的正确诊断率。 　　组织病理检查虽然不能鉴定菌种，但可根据真菌在甲板中的分布及寄生时的状态对其进行大致分类，与真菌培养结合可提高诊断的准确性。当标本中分离出酵母菌或/和霉菌时，判断其是污染菌还是致病菌存在一定困难，借助病理学检查可以对此进行鉴别。本次实验未发现混合感染的标本，对分离出的链格孢，毛壳菌属及其他霉菌经组织病理检查证实为污染菌。目前，霉菌性甲真菌病的诊断仍是一个难题，各实验室对于结果的判定、培养的次数、培养的方法以及是否采用组织病理学等辅助手段缺乏统一的标准，混合感染的判定也存在类似的问题。 　　扫描电镜对病甲的观察，在微观水平证实了红色毛癣菌及须癣毛癣菌对甲板的破坏能力，其菌丝可穿入角质层或穿行于角质细胞中，造成角质层松解、角质细胞破碎不整、排列紊乱，形成不规则的腔洞。比较三个甲面检出真菌的情况，腹侧面检出的机率高。 　　(致谢　本课题同时得到北京医科大学医院西安杨森皮肤科学教育研究基金资助。王爱平医师、王晓红、万哲、陈伟技师协助收集临床标本，深表谢意。)

孟悦（现在北京友谊医院）
李若瑜（北京医科大学医院皮肤科　邮政编码 100034） 涂平（北京医科大学医院皮肤科　邮政编码 100034） 王端礼（北京医科大学医院皮肤科　邮政编码 100034）
参　考　文　献
1，Barranco V.New approaches to the diagnosis and management of onychomycosis.Int J Dermatol,1994，33:292.
2，Elewski BE.Diagnostic techniques for confirming onychomycosis.J Am Acad Dermatol,1996,Sep 35(3pt2):S6.
3，Daniel CR.The diagnosis of nail fungal infection.Arch Dermatol,1991,127:1566.
4，Midgley G,Moore MK,Miss J.Mycology of nail disorders.J Am Acad Dermatol,1994,Sep 31(3pt2):S68.
5，Pierard GE,Arrese JE,et al.Present and potential diagnostic techniques in onychomycosis.J Am Acad Dermatol,1996,Feb 34(2pt1):273.