丹酚酸B对离体培养内皮祖细胞VEGF、bFGF mRNA表达及抗氧化酶活性的影响

作者：薛亮,范英昌,李庆雯,南亚昀　　作者单位：天津中医药大学病理教研室，天津 300193

　　【摘要】目的探讨中药单体丹酚酸B对离体培养内皮祖细胞(EPCs)细胞因子mRNA表达及抗氧化酶活性的影响。方法密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化EPCs，免疫细胞化学法鉴定。选择丹酚酸B佳药物浓度干预的EPCs，采用实时荧光定量PCR(RTPCR)检测细胞VEGF,bFGF mRNA表达，测定细胞培养液抗氧化酶SOD,GSHPx的活性。结果 丹酚酸B组VEGF，bFGF mRNA的表达量增加，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。丹酚酸B组细胞培养液中SOD活性增强，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);GSHPx活性有增强趋势，但与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。 结论 丹酚酸B对EPCs具有保护作用，增强其细胞功能的部分机制与其增强分泌细胞因子VEGF和bFGF mRNA的表达，并且促进细胞释放SOD、GSHPx，清除自由基能力增强有关。
　　【关键词】 丹酚酸B;内皮祖细胞;细胞因子;抗氧化酶

　　【Abstract】 ob[x]jective To explore the effects of traditional Chinese medicine monomer Sal B on cytokine mRNA ex[x]pression and activity of antioxidant enzymes of endothelial progenitor cells (EPCs) in vitro. Methods Cultivation and purification of EPCs in vitro was by densitygradient centrifugation and plastic adherence method，and identified by immunocytochemistry. EPCs were intervened by best concentration of Sal B, the ex[x]pressions of VEGF, bFGF mRNA were detected by RTPCR, the activity of antioxidant enzymes SOD, GSHPx activity of cell culture fluid were tested. Results VEGF, bFGF mRNA ex[x]pression of Sal B group were increased, which had statistically significant difference compared with those of control group (P<0.05). SOD activity was enhanced of Sal B group, which had statistically significant difference compared with that of control group (P<0.05). Sal B group strengthened the trend of the activity of GSHPx , but there was no significant difference compared with that of control group (P>0.05). Conclusions Sal B plays a protective role and enhances its cell function on EPCs, the part of the mechanism is that enhances the ex[x]pressions of VEGF,bFGF mRNA, promotes the cells to release SOD, GSHPx, and enhances the scavenging capacity of free radical.

　　【Key words】 Sal B; Endothelial progenitor cell; Cell factor; Antioxidant enzymes

　　内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮的前体细胞，参与成体血管新生，是治疗缺血性疾病和改善微环境的良好种子细胞，具有广阔的应用前景〔1〕。前期研究显示活血化瘀中药丹参的主要水溶性成分丹酚酸B(Sal B)对EPCs具有保护作用，增强其细胞功能〔2〕。本文从细胞因子血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA表达和抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)入手，观察Sal B对离体培养EPCs细胞因子mRNA表达及抗氧化酶活性的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物

　　Wistar大鼠，雄性，体质量(120±20) g(中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk20050001)。
　　1.2 主要仪器和试剂
　　LDMEM;特级胎牛血清;VEGF，bFGF，纤维连接蛋白(R&D);大鼠单个核细胞分离液(天津灏洋生物);CD34兔多克隆抗体，CD133兔多克隆抗体;Sal B(天津天士力现代中药资源有限公司，批号20060601)。免疫细胞试剂盒(天津灏阳生物)，二氨基联苯胺(DAB)(Sigma公司);二苯基四氮唑溴盐(MTT)(联星生物)，TaqMan Reverse Transc[x]ription Reagents和SYBR Green PCR Master Mix reagent kits试剂盒(Applied Biosystems)，Trizol总RNA提取试剂(天津润泰科技发展有限公司);SOD、GSHPx生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
　　CO2恒温培养箱(model TC2323 CO2 incubator);倒置相差显微镜(XD101 98010)，超净化工作台(HITACHI)，台式高速低温离心机(Hermlez323K美国)， UV530紫外分光光度计(上海生物仪器厂)，PCR仪(美国HYBAID)，ABI7300实时定量PCR仪，细胞培养管(EP管);半自动生化仪(RT9200，成都贝斯达仪器有限公司);HH6数显恒温水浴锅;离心机(LDZ52);酶标仪(美国BioRad);无菌手术器械;磁力搅拌器;电子天平(BS1101S 德国)。
　　1.3 方法

　　1.3.1 EPCs培养与鉴定
　　采用贴壁筛选和密度梯度离心结合法〔1〕：大鼠脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，DHank液冲洗骨髓，筛网过滤，制成单细胞悬液，按等比例缓慢滴加悬液于大鼠单个核细胞分离液(密度为1.080 g/ml)之上，2 000 r/min，离心15 min，抽取灰白色的单个核细胞层，用DHank′s离心洗涤后，以2.0×105/cm2的密度接种纤维连接蛋白(5 μg/cm2)在包被的培养瓶中，LDMEM(含体积分数为15%胎牛血清，15% VEGF，15% bFGF)，置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中，4 d后换液，继续培养至第7天。选取生长良好的细胞培养至7 d的EPCs，用链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)法检测细胞表面抗原CD34、CD133。CD34、CD133定位于细胞膜及细胞质。以细胞膜和细胞质出现棕黄色、高出背景色者为阳性细胞。
　　1.3.2 MTT方法检测Sal B的佳药物浓

　　度 根据文献报道设立0，0.5，1，2，4，8，16，32，64 μg/ml药物浓度，分别测定细胞的OD值，根据OD值均数曲线图确定Sal B的佳药物浓度。
　　1.3.3 实验分组

　　细胞培养第7天后，以0.25%胰酶将各孔细胞消化下来制成细胞悬液，以等数量细胞接种于12孔板，随机分为2组：①对照组：LDMEM培养液(含15%胎牛血清、15%VEGF，15% bFGF); ②实验组：LDMEM培养液加入筛选出佳浓度的Sal B，培养24 h，进行检测。
　　1.3.4 实时荧光定量PCR(RTPCR)检测细胞VEGF,bFGF mRNA表达

　　1.3.4.1 细胞总RNA提取

　　①按试剂盒操作说明，直接将裂解液Trizol加入12孔板，每孔1 ml，每组设6个复孔，分别用加样器反复吹打几次，混匀;②将匀浆样品在室温放置10 min，使核酸蛋白复合物完全分解，吸取匀浆样品放于1.5 ml无Rnase的离心管中;③每个离心管中加入0.2 ml氯仿，涡旋混合器剧烈震荡15 s，室温放置3 min，令样品萃取分层; ④4℃，12 000 r/min，离心15 min，样品分为三层黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要存在于水相中，将上清水相转移到预冷新管中，约500～600 μl;⑤每管缓慢加入与上清等量的冷异丙醇(-20℃预冷)，轻轻混匀，于-20℃静置2 h，使核酸沉淀;⑥4℃，12 000 r/min，离心10 min，弃上清，在管侧壁和管底形成白色胶状沉淀(RNA);⑦缓慢沿管壁加入1.2 ml 75%乙醇(DEPC水配置)，洗涤沉淀，4℃，8 000 r/min，离心10 min，弃上清，剩余液体短暂离心，然后用枪头吸出，将沉淀室温放置2～3 min晾干，每管加入35 μl RNase Free ddH2O，轻轻吹打数次，溶解RNA，分装，备用。
　　1.3.4.2 总RNA纯度、浓度测定及完整性检验
　　取1 μl总RNA样品，加入到99 μl去离子水的比色皿中，混匀后紫外分光光度计测定OD260、OD280以及二者比值。OD260/OD280比值应在1.8～2.0范围，以此衡量RNA纯度。根据公式“OD260×40 μg/ml×稀释倍数/1 000”计算总RNA浓度。
　　另取总RNA 4.5 μl与0.5 μl上样缓冲液混合进行1%琼脂糖凝胶电泳，应用BIO IMAGING SYSTEM拍照，于凝胶成像系统中观察电泳结果，以出现28 S、18 S和5 S三条带确定RNA的完整性。
　　1.3.4.3 cDNA合成

　　根据试剂盒说明确定反应体系如下：总反应体系10 μl，10×Taq Man RT Buffer 1.0 μl;25 mmol/L MgCl2 2.2 μl;deoxyNTPs Mixture 2.0 μl;Random Hexamersb 0.5 μl;RNase Inhibitor 0.2 μl;MultiScribeTM Reverse Transc[x]riptase 0.25 μl;样品总RNA 0.2 μg;反转录反应条件：70℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min，终止反应。
　　1.3.4.4 目的基因VEGF,bFGF及内参照基因βactin扩增 ①PCR扩增：在PCR仪中，bFGF、VEGF反应条件为：94℃ 5 min预变性后;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共32个循环;再于72℃延伸7 min。各目的基因及内参照基因特异性引物序列，βactin反应条件为：94℃ 5 min预变性后;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共28个循环;再于72℃延伸7 min。总反应体系为50 μl，包括cDNA 3 μl，1 mmol/L dNTPs 10 μl，10×Taq聚合酶buffer 5 μl，目的基因和βactin上下游引物各2 μl(10 pmol/L),Mg2+3 μl，去离子水24 μl，Taq酶1 μl。引物序列见表1。②所得CT值经转换后以2-ΔΔCT相对定量法获得每个样本各目的基因相对表达量数值。表1 各目的基因及内参照基因引物序列
　　1.3.5 细胞培养液抗氧化酶的测定

　　两组EPCs培养于12孔板中，培养条件同前，7 d后收集培养液，每组取6孔样本，2 000 r/min，离心10 min，取上清，比色分析法测定培养液SOD和GSHPx活性，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。
　　1.4 统计学分析
　　使用SPSS11.5统计软件，数据以x±s表示，采用两独立样本t检验。
　　2 结 果
　　2.1 Sal B佳药物浓度
　　确定Sal B的佳药物浓度为8 μg/ml，此剂量可使细胞生长状态佳，细胞活力强。见表2。表2 不同浓度Sal B作用于EPCs后细胞的吸光度值
　　2.2 Sal B对EPCs VEGF,bFGF mRNA表达的影响
　　Sal B组VEGF，bFGF mRNA的表达量增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。表3 两组VEGF,bFGF mRNA相对表达量的比较

　　2.3 Sal B对EPCs培养液SOD,GSHPx活性的影响

　　Sal B组细胞培养液中SOD活性增强，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);而GSHPx活性有增强趋势，但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。表4 两组细胞培养液SOD,GSHPx活性的比较

　　3 讨 论
　　EPC可在生理和病理状态下被招募到目的部位，通过血管生成和血管形成机制分化为血管内皮细胞，从而更新和修复衰老或受损的内皮细胞。在机体缺血、组织损伤和细胞因子(或药物)刺激下，EPC可从骨髓向靶部位动员、分化及增生，形成新生血管〔3〕。外周血循环中EPCs的数量与功能决定着损伤血管的内皮修复程度。
　　VEGF刺激内皮增殖、增强血管通透性,bFGF刺激内皮细胞、SMC和成纤维细胞增生,二者作为血管内皮细胞生长刺激因子,可以协同特异性地作用于血管内皮细胞,刺激其增殖,促进侧支血管的形成，从而改善组织器官的血液供应，对抗组织缺血〔4～6〕。在保护细胞免受或减轻活性氧损伤的过程中,细胞内SOD和GSHPx等具有抗氧化酶的作用〔7〕。氧化应激能引起EPCs数量减少和功能减弱。虽然EPCs存在抗氧化酶系统,但是当细胞正常的氧化还原稳态失衡时,ROS过度产生而聚积,引起氧化应激,使DNA、蛋白质、碳水化合物和脂质等生物大分子被氧化,导致细胞的衰老和凋亡〔8〕。丹参是活血化瘀中药，具有活血通经功效，其主要水溶性成分Sal B可促进恢复受损内皮的功能，在治疗心血管疾病等方面发挥着重要作用〔9〕。研究显示佳药物浓度的Sal B(8 μg/ml)作用于EPCs提高了其分泌细胞因子VEGF和bFGF mRNA的表达，并且促进了细胞释放SOD，GSHPx，清除自由基能力增强，说明Sal B具有抗氧化损伤的作用，对EPC具有保护作用，增强其细胞功能的部分机制与此相关。同时该实验结果也可为体外扩增EPCs而进行在体实验提供了依据。
　　【参考文献】
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　　3 余 毅，谢福安，周丽娜.内皮祖细胞在缺血性疾病中的研究进展〔J〕.世界临床药物 2009;30(5)：2926.

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