肿瘤蛋白指纹技术在消化道肿瘤诊断中的作用研究进展

　作者：蒲晏均, 徐亮,夏冬

　　【关键词】 消化道肿瘤;肿瘤蛋白组学;血清肿瘤标志物;指纹蛋白技术
　　我国居民每死亡5人中，即有1人死于癌症。近年来，随着环境的变化，人们生活方式的改变和生活压力的增加，我国癌症的发病年龄提前了15～20年，35～55岁发病群体比率趋于上升[1]。不仅影响了人们的生活质量而且大大减小了人均寿命值。所以癌症的早期诊断无疑在治疗与预后上有着不可替代的重要性，而许多恶性肿瘤直至晚期甚至已经出现严重并发症才得以诊断，特别是消化道恶性肿瘤起病隐匿，症状和良性疾病相似，所以容易被患者和医生忽略。消化道恶性肿瘤在所有恶性肿瘤的发病和死亡中占据前列。因此做好消化道恶性肿瘤的防治工作在一个地区的癌症控制规划中占有很重要的地位。
　　1血清标记物在消化道肿瘤诊断发展

　　血清肿瘤标志物的寻找存在许多的困难。几乎全部的肿瘤特征蛋白质浓度都很低，其次蛋白浓度是动态变化的，应激状态、疾病或治疗后就可能会发生显著的变化，在传统的检测方法中，双向凝胶电泳技术是一项检测血清中蛋白标记物浓度的成熟方法。通常双向凝胶电泳技术与质谱分析技术配对使用来鉴别蛋白质，为了保证分析和临床应用的可靠性，筛选生物标记物的分析工作往往需要比较大量的样本，所以该方法费力又费标本，不适合大规模普查及临床检测。双向凝胶电泳技术对于低分子量蛋白质和低浓度蛋白质的检测依然存在一定的盲区[2]。所以这一技术对于筛选特异的低丰度或低分子量的生物标记物存在许多的困难。表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术(surface-enhancedlaserdesorption/inionation-timeofflight-mass spectra, SELDI-TOF—MS)的出现弥补了上述技术的许多不足和问题[2]。
　　2肿瘤蛋白指纹诊断的原理
　　蛋白质是基因功能的执行者，疾病相关基因组(包括癌基因等)的活化就会表达特异的蛋白质，随着蛋白质组学的兴起，业已证明蛋白指纹图谱分析是有效的早期诊断恶性肿瘤的具有划时代的诊断新模式。新的检验技术体现了质的飞跃! 蛋白指纹图谱技术不同于只能单一指标分析的传统肿瘤标志物，通过对蛋白质动态、全景的分析，将病人疾病早期微小基因表达产物(蛋白质或多肽)系统地分析，获得待检标本中各种蛋白的含量和蛋白质分子量等信息，绘制成蛋白指纹图谱(EPG)，通过计算机软件与正常人、亚健康状态人群、良性疾病和癌症病人的指纹图谱库对照，比较分析差异，就能快速、敏感和特异地发现和捕获新的与疾病相关的蛋白。
　　2.1SELDI的工作原理
　　蛋白指纹图谱技术是由蛋白质芯片及分析仪器SELDI—TOF—MS(表面加强激光解析电离飞行时间质谱)两部分组成，SELDI是以色谱原理设计的蛋白芯片，在飞行质谱的检测系统中，蛋白芯片根据色谱原理，表面经化学(阳离子、阴离子、疏水、亲水和金属离子整合等)或生物化学(抗体、受体、DNA等)处理，芯片特异性地和血清中测定蛋白结合，再通过选择性清洗，获得高分辨率的保留蛋白谱(第1次分离)。当加入能量吸收分子(EAM)后，芯片上保留的蛋白形成晶体。在特异的激光照射后，晶体发生解离作用，带电分子在通过电场时加速，记录仪记录飞行时间的长短，质量越轻，相对所带的电荷越多(质荷比m/z越小)，飞行时间越短。信号由高速的模拟数字转化器传化并记录，被测定的蛋白质以一系列峰的形式呈现，这些特异的峰可看成此类疾病的指纹[3]。单个蛋白在谱图上的位置取决于飞行时间。SELDI携有特有的软件，能快速处理、分析大量的信息。SELD1分析的蛋白峰的质谱图的横轴表示蛋白类型，纵轴代表蛋白质的强度和丰度。进行定量测定。可以将患者血清中蛋白质成分的变化记录下来，绘制成蛋白指纹质谱图，并显示样品中各种蛋白的分子量、含量等信息。从而鉴别癌症患者和非癌症患者的血清蛋白质组图谱。这样就能终发现和捕获新的特异性相关蛋白及其特征，整个测定只需几十分钟即可完成。
　　2.2SELDI的优点
　　(1) 待测样本来源广，不需要特殊处理，可以直接点样检测，如血清、尿、组织液等;(2)检测样本用量小且范围广(0.5~400“L)、敏感性高(<1 fmole);(3)小型实验或高通量检测可自由选择，一次可测8、16、96或192个样品，可满足临床检测、普查或大样本筛查之需要;(4)可检测蛋白质分子质量范围大(0~500 ku);(5)应用范围广，如肿瘤的早期诊断、疗效监测、复发早期预警及患者预后评估，发病机制的探讨，药物毒理学研究和毒物检测、蛋白质纯化及功能鉴定，抗原、抗体、受体、配体、底物等检测，DNA、RNA及蛋白质调控研究，蛋白质甲基化、磷酸化、糖基化研究等;(6)检测快速，可重复性较好;(7)检测敏感而而且特异性较高，对常见肿瘤的诊断达80~90%以上，目前其他方法无法比拟.因此，sELDI蛋白指纹技术在肿瘤等疾病的早期诊断等研究中具有广阔的应用前景。
　　3SELDI的临床应用
　　3.1胃癌在我国及整个世界范围内都是常见的恶性肿瘤， 目前缺乏早期特异性血清学诊断标记物。蛋白指纹技术已经在胃癌的早期诊断、手术后随访、胃癌的病因研究中得到应用，已检索到10篇论文有学者运用SELDI-ToF.MS蛋白质芯片技术，得出了胃癌患者不同于健康人的血清蛋白质指纹图谱。通过胃腺癌组与健康组比较：发现5910Da、5084 Da、8691 Da这三个蛋白质峰具有显著性差异。应用判别分析建立的能达到佳诊断效果的蛋白质峰组合建立诊断模型，交叉验证结果较满意，其灵敏度和特异度均远高于现有的各种肿瘤标志物，具有较高的诊断价值。
　　3.2大肠癌随着我国人民生活水平的提高，膳食结构改变，近年来，大肠癌的发病率有上升的趋势。目前， (CEA)敏感性及特异性不高，分别为60%和23%，寻求早期诊断结、直肠癌的特异方法是目前临床亟待解决的问题。蛋白指纹技术应用为诊断、治疗、发病机制研究开辟一条新的途径。已经检索到用蛋白指纹技术测大肠癌血清差异表达蛋白报告有14篇[4]。大肠癌血清标记物CEA的敏感性为60%，但特异性仅为23%，远远不能满足早期诊断的要求.高春芳利用sELDI技术对62名正常人和32例大肠癌患者进行血清蛋白相对含量的分析，发现10个蛋白在两组中有显著性差异，对于大肠癌的识别的准确率为98.3%，敏感性和特异性分别为97.3%和.上述结果表明该技术对于大肠癌的早期检出不论在敏感性还是在特异性均优于传统的诊断技术.

　　3.3食管癌食管癌是我国常见恶性肿瘤之一。食管癌与正常组比较血清蛋白质谱差异表达模型：检测38例正常者与36例食管癌患者的血清标本，在分子量2000～20 000范围内，共检测到31个蛋白质荷比峰，差异有统计学意义(P<0.01)。SVM建立诊断模型(由4个质荷比峰m/z值为5346、5644、5914和8776 Da构成)。
　　3.4肝癌甲胎蛋白(AFP)是目前临床上常用的肿瘤标记物，但对于肝癌诊断的敏感性只有43%，特异性46%.我们利用sELDI技术发现肝癌患者和正常人的血清蛋白质指纹图谱之间有17个稳定的标志蛋白，其中有6个标志蛋白在肝癌患者血清中高表达，11个标志蛋白在肝癌患者血清中低表达[1].分析系统筛选出13 752 u及11 472 u标志蛋白建立起一个肝癌的诊断模型，对肝癌的诊断特异性为97.06%，灵敏度为91.18%，及阳性预测率为96.88%.此结果对肝癌的早期发现、早期治疗无疑具有重要价值[5]。
　　3.5胰腺癌胰腺癌是肿瘤的第4大死因，在实性肿瘤中预后差，归其原因主要是由于早期诊断困难，只有10%~15%的患者在发现时是可切除的小肿瘤.目前尚无可用于胰腺癌筛查的有效方法，血清学肿瘤标记物cAl9-9的敏感性和特异性尚不能满足胰腺癌早期诊断的需要.KoopmaJln ef∥161应用SELDI技术对胰腺癌、非恶性肿瘤患者和正常人各60例进行筛查，发现了2种血清标记物对于区分胰腺癌与非肿瘤有97%的特异性，明显优于目前临床上使用的任何一种肿瘤标记物[3]。
　　4SELDI存在的问题及展望

　　蛋白指纹图谱(EPG)是划时代的诊断模式。记录人体内正常及疾病蛋白质全景状态或全面变化的生命光盘，就象心电图对心脏功能的评估一样，人人应有一份，特别是对40岁以上人群。蛋白指纹图谱作为早期定性手段，还无法进行定位，需要与PET相结合才能成为“黄金搭档”。几年前，美国国立肿瘤研究院(NCI)主席Andrew von Eschenbach就宣告，美国将用蛋白指纹图谱技术对肿瘤早期定性和PET对肿瘤早期定位相结合等手段对瘤做出极早期诊断，使肿瘤在2015年成为非致死性疾病[6]。相信随着SELDI技术的不断完善，其将在疾病的诊断、疗效监测等方面发挥日益重要的作用。
　　【参考文献】
　　[1]张辉.高春芳.赵光.王秀丽飞行质谱技术筛选肝癌肿瘤标志物的临床意义[J].中华实验外科杂志,2006,(23)-3:279-281.

　　[2]Zhang H.Kong B.Qu X..et al .Biomarker discovery for ovarian cancer using SELDI-TOF-MS[J].Gynecol 2006,(102):61-66.

　　[3]Melle C,Ernst G,Schimmel B,et al.Characterization of pepsinogen C as a potential biomarker for gastric cancer using a histopreteomic approach[J].J Proteome Res,2005,4(5):1799-1804.

　　[4] 陈益定,郑树,余捷凯.胡汛血清蛋白质质谱模型在大肠癌诊断中的应用[J].中华肿瘤杂志,2004(26)-7:417-419.

　　[5]刘池波，孙灵芬，梁勇。血清蛋白质谱模型在肝硬化诊断中的应用[J].中华检验医学杂志，2006，(29).6;529-530.

　　[6]Dominguez DC,Lopes R,Torres ML.Proteomics technology [J].Clin lab sci，2007,20(4):239-244.