癌症免疫研究的助推器！免疫基因组学&单细胞时代的免疫组学
文章来源：贤集网发布日期：2022-03-26浏览次数：365 在过去的几年里，随着研究人员深入研究肿瘤已经对肿瘤的认识发生了变化。肿瘤的定义也从肿瘤细胞聚集转变为肿瘤细胞，免疫细胞，成纤维细胞，血管内皮细胞和其他基质细胞组成的复杂器官样结构。器官内的所有结构，包括免疫浸润，血管，细胞外基质等也称为肿瘤免疫微环境（TIME）是肿瘤研究的热门课题。随着肿瘤免疫的发展，TIME在癌变，肿瘤进展，转移，复发和潜在治疗靶点中十分重要。TIME组分主要分为免疫细胞和分泌因子。TIME中包括多种免疫细胞亚群，如T淋巴细胞，B淋巴细胞，自然杀伤细胞，巨噬细胞，树突状细胞和髓源性抑制细胞等。其中，T细胞，B细胞，NK细胞和巨噬细胞会抑制肿瘤生长而髓源性抑制细胞和调节性T细胞会抑制抗肿瘤免疫。然而，也有研究表明CD8+T细胞的抗肿瘤功能可能会通过T细胞衰竭而受到抑制。总的来说，不同免疫细胞类型和特定免疫细胞类型的不同功能状态都可能对抗肿瘤免疫产生不同的作用（图1）。因此，使用生物信息分析表征肿瘤免疫学特征并加深研究人员对肿瘤免疫的理解十分重要。图1肿瘤免疫微环境的组分和互作1.NGS时代的免疫组学技术——免疫基因组学在过去的20年里，使用WGS，WES和RNA-seq数据成功构建了人类的参考基因组，为癌症免疫应答研究奠定了基础。与Sanger测序相比，二代测序（NGS）可以获得高通量的基因组学数据和转录组学数据，为研究免疫应答提供有价值的信息。在NGS时代，免疫基因组学不仅包括免疫细胞的全局图谱，还包括通过异常肽预测，HLA分型和MHC-肽结合亲和力预测免疫原蛋白。1.1 TIME的免疫细胞定量研究肿瘤免疫微环境（TIME）由各种免疫细胞组成。以往的肿瘤免疫细胞组成研究中，传统的流式细胞技术和免疫组化（IHC）方法由于成本高和组织可得性低无法进行大规模分析。基于NGS技术，由于细胞的高度异质性不同免疫细胞类型的基因表达情况差异很大，因此可以使用NGS数据评估不同免疫细胞类型的丰度。接下来主要讨论基于RNA-seq数据的方法，分为基因集富集分析（GSEA）和反卷积分析两种方法（图2和图3）。图2基于NGS数据的肿瘤免疫基因组学计算工具图3免疫细胞定量算法的优点和缺点基于GSEA的算法包括ESTIMATE，xCell和MCP-counter。ESTIMATE算法使用免疫打分和基质打分表示免疫细胞和基质细胞的比例分布，但不能区分特异性免疫细胞类型。xCell基于ssGSEA方法从多个RNA-seq和芯片数据中获取不同细胞类型的基因集，从而增加模型的鲁棒性。xCell可以良好的区分高度相似的细胞类型。MCP-counter根据标记基因的表达水平计算免疫细胞的丰度打分。基于反卷积的算法包括DeconRNAseq,PERT,CIBERSORT,TIMER,EPIC,quanTIseq和deconf。CIBERSORT是基于反卷积算法常用的工具之一，CIBERSORT利用线性支持向量回归和基因表达矩阵表征免疫细胞浸润水平。QuanTIseq是为RNA-seq数据设计的，分析流程包括RNA-seq数据预处理，基因表达量化和基于约束小二乘回归的反卷积。目前，ESTIMATE,CIBERSORT和MCP-counter是常用的计算免疫细胞组分的方法，其中CIBERSORTx适用于单细胞转录组数据。免疫基因组学技术广泛应用评估特定类型癌症的整体免疫细胞浸润水平。在多组学研究中，xCell用于描述肾透明细胞癌，肺腺癌和头颈部鳞状细胞癌的免疫细胞水平。对TCGA数据库的33种癌症类型的免疫细胞类型进行分析，Thorsson等人将癌症免疫状态分为6个不同簇并使用CIBERSORT分析这6个免疫亚型的免疫细胞组成并比较不同病理特征和治疗反应的患者的TIME组成。Gil等人使用CIBERSORT揭示乳腺导管原位癌（DCIS）和乳腺浸润性导管癌（IDCs）的浸润T细胞亚群的差异。CD8+T细胞富集与DCIS中而Tregs和CD4+T辅助细胞富集与IDC中。总的来说，结合NGS数据和生物信息学算法可以区分免疫细胞类型。然而，免疫细胞包括不同性质和生物学功能的亚型。因此，单细胞技术的发展可以更加有效的分辨细胞亚型。1.2鉴定肿瘤抗原基因组水平突变，转录组水平突变和蛋白水平改变均会导致异常蛋白的表达，例如肿瘤抗原。这些蛋白可以被免疫细胞识别并触发抗肿瘤免疫应答。其中，病毒抗原，癌症生殖系统抗原和新抗原均具有较高的肿瘤特异性，目前已成为肿瘤疫苗的主要靶点。因此，作者主要讨论这些肿瘤特异性抗原的鉴定。根据抗原识别过程，免疫基因组学可以通过计算分析预测异常多肽，进行HLA分析，预测MHC-多肽结合亲和力（表1）。基于WES,WGS和RNA-seq数据预测异常多肽。体细胞DNA突变主要包括单核苷酸突变（SNVs）和小片段差异缺失（Inde），接下来主要介绍鉴定DNA突变的工具。GATK是基于WES,WGS和RNA-seq数据鉴定SNV和Indel的金标准，同样可以用于鉴定CNVs和SV。而对于低频突变，LoFreq和MuTect的敏感性和特异性较高。VarScan2和SomaticSniper需要较高的等位基因分数才能保证较高的灵敏度。此外，VarScan，FreeBayes，Samtools，Vardict和EBCall可用于肿瘤抗原鉴定。然而，目前没有工具可以较好地处理假阴性和假阳性。如何优化现有工具，设计一个多功能，高效的突变鉴定工具，以便较好的处理假阴性和假阳性是值得研究的问题。通过将VarScan，GATK,Pindel,BreakDancer,Strelka和Genome STRiP集成到一个Web界面中——GenomeVIP，已应用于TCGA等大型项目中。此外，好选择两种以上工具来鉴定突变。HLA分型。异常肽需要结合HLA来辅助TCR识别，从而引起免疫反应。HLA基因分为Ⅰ类和Ⅱ类，不同HLA与异常蛋白的结合亲和力不同。因此，预测HLA分型对肿瘤抗原识别至关重要。尽管PCR和测序方法是标准的HLA分型方法，但是其低通量限制其应用范围。HLA-miner和Seq2HLA是早期用于HLA分析的工具。近年来，PHLAT,HLAreporter,SNP2HLA,HLA-HD,Optitype和HLA-VBSseq等工具在提高HLA分析准确率和分辨率方面做出了很大努力。其中，Polysolver可以实现HLA高精度分型，并使用低覆盖度的WES数据。然而，HLA类型的复杂性，仍然需要可以准确进行HLA分型的工具。预测抗原-MHC结合亲和力。MHC分子可以分为Ⅰ类，Ⅱ类和Ⅲ类三种亚型，Ⅰ类MHC分子（MHC-Ⅰ）与肿瘤免疫治疗有关，Ⅱ类MHC分子（MHC-Ⅱ）与癌症患者预后良好有关而Ⅲ类MHC分子（MHC-Ⅲ）在细胞表面不表达，因此不做进一步讨论。与MHC-Ⅱ分子相比，MHC-Ⅰ能够结合8-11个氨基酸的短肽。基于人工神经网络（ANN）训练模型和位置特异性打分矩阵（PSSM）开发了NetMHC和NetMHCpan等工具，可以用于预测pMHC-Ⅰ的结合亲和能力。仅基于PSSM开发的工具PSSMHCpan同样可以准确高效的预测pMHC-Ⅰ的结合亲和能力。Li等人通过训练包括87个等位基因的数据集和独立测试集的结果表明PSSMHCpan优于其他方法，然而需要进一步的研究证明其结果。目前，预测pMHC-Ⅰ的结合亲和能力的金标准是NetMHCpan-4.1。pMHC-Ⅱ的形成过程与pMHC-Ⅰ类似，但通常会结合更长的肽段。由于MHC-Ⅱ结合多肽长度的多样性和HLAⅡ类多肽结合位点的开放性，使开发预测工具具有一定难度。目前已有的工具包括CONSENSUS，ProPred，MixMHC2pred，MHCnuggets，NetMHCII和NetMHCIIpan。Nielsen等人使用Reynisson et.106的数据集进行分析表明NetMHCIIpan-4.0优于其他方法。尽管这些工具的原理，用法和输入输出格式有所不同，但是其灵敏度，准确性和可用性等方面都不完美。为了更准确的预测肿瘤抗原以协助后续疫苗设计还需要开发更加准确的工具。2.单细胞时代的免疫组学尽管NGS技术对肿瘤免疫的研究极大的促进了肿瘤学的发展，但是bulk测序技术是从组织或细胞群中提取RNA和DNA，并得到整体的平均表达水平。然而，由于肿瘤内的异质性和免疫细胞的多样性，bulk测序掩盖了很多重要的生物学现象。随着单细胞测序技术的发展，使研究水平从组织水平精细到单细胞水平（图4）。图4单细胞水平的免疫组学技术比较2.1基于单细胞的肿瘤免疫细胞研究肿瘤组织作为一个高度复杂的组织，其生物学行为，包括癌变，肿瘤进展，转移，复发和治疗反应都依赖于肿瘤细胞与周围细胞的互作。因此，确定TIME特征和细胞组分对肿瘤免疫研究十分重要。2.1.1基于蛋白质的单细胞分析流式细胞术。流式细胞术是利用荧光染料偶联抗体识别和量化细胞类型，流式细胞技术在研究肿瘤免疫细胞，区分不同免疫细胞亚群方面发挥重要作用。常规的流式细胞仪是8参数流式细胞仪，随着技术的进步，还开发了30和50参数的流式细胞仪。多参数流式细胞仪可以从用一样本中获得更多的信息。目前，已开发了很多工具用于数据预处理，细胞亚群识别，聚类和可视化等。然而，尽管流式细胞仪可设置的参数变多但是精度却没有提高，这一缺点在一定程度上限制了流式细胞仪的应用和发展。质谱流式细胞技术。质谱流式细胞技术又称为飞行时间流式细胞技术（CyTOF）是该领域的新技术，他将流式细胞技术和质谱技术相结合。与传统的流式细胞技术相比，该方法使用金属同位数标记抗体并使用飞行时间探测器对信号量化。CyTOF可以对肿瘤组织绘制免疫细胞图谱并鉴定生物标记物。Chevrier等人使用质谱细胞技术绘制肾透明细胞癌TIME图谱和与临床特征相关的免疫组分。Friebel等人发现大脑对癌症的免疫反应是由癌症类型决定的，使用CyTOF可以根据组织和侵入性免疫细胞的异质性组成对原发性脑肿瘤和脑转移患者的TIME进行定位和分析。光谱流式细胞技术。光谱流式细胞技术是使用荧光染料标记抗体并使用色散光学和新型探测器代替经典光学和常规探测器。随着技术的发展，光谱流式细胞技术可能会取代多色流式细胞技术。流式细胞技术，质谱流式细胞技术和光谱流式细胞技术都是基于特定标签与相应细胞亚群结合并识别标签，因此在收集样本前必须确定相应靶点。由于这一原因可能会降低结果的准确性。此外，成本，速度和可操作性都应该是需要考虑的问题。2.1.2单细胞RNA测序单细胞测序技术的出现使研究水平细化到单细胞水平。基于NGS，单细胞测序可以分为单细胞分离和单细胞分析两步。单细胞分离包括FACS，激光显微切割，手动细胞挑选，随机稀释和微流控芯片等。单细胞分析包括单细胞基因组学，单细胞转录组学，单细胞蛋白质组学和单细胞代谢组学。目前，单细胞转录组学应用范围较为广泛且相对成熟。Zeisel等人使用scRNA-seq揭示小鼠皮层和海马体中的细胞类型。Tirosh等人使用scRNA-seq揭示转移性黑色素瘤患者的细胞亚群，为靶向治疗和免疫治疗提供有价值的信息。此外，将单细胞DNA和RNA测序相结合描绘了TNBC患者的化疗抗性的进化轨迹，为治疗提供有价值的信息。单细胞测序主要分为单细胞样本制备，全基因组或转录组扩增，文库制备，测序和数据分析等5个步骤。2.1.3用于鉴定TIME空间结构的方法越来越多的研究表明TIME的组成和空间结构都会显著影响抗肿瘤免疫。然而，上述介绍的单细胞技术不能应用于研究TIME的空间结构。因此，接下来按照发展阶段简单介绍几种可以应用于研究单细胞空间结构的技术（图5）。图5单细胞空间技术的发展初始阶段：HE染色。在初始阶段使用HE染色的肿瘤样本载玻片的组织成分进行显微镜分析，研究人员可以区分嗜碱细胞核和嗜酸细胞质，从而提空空间结构图像。然而，在没有特定标记的情况下，研究人员只能根据经验将细胞划分为几大细胞亚群并不适合表征TIME的空间结构。发展阶段：mIHC&mIF。免疫标记的发展显著改变了TIME空间结构的方法。IHC和IF利用特定细胞中抗原的荧光染料或酶标抗体来细分细胞类型。多重免疫组织化学/免疫荧光（mIHC/IF）能够同时检测单个切片上的多个标记，从而提高研究人员对TIME空间结构的了解。成熟阶段：CODEX,IMC和MIBI-TOF。CODEX是一种多路细胞计数成像方法，利用包含独特寡核苷酸序列涉及特定barcode代替荧光染料或酶标基因。CODEX的准确度高于mIHC/IF。Goltsev等人使用CODEX在患有系统性自身免疫性疾病的冷冻动物脾组织中观察到脾细胞互作动力学效应。多重荧光显微镜法（MxIF）和多表位配体制图（MELC）可以在单样本中检测多100种抗原。MxIF优于MELC，它可以定量FFPE组织中多种分析物，单细胞和亚细胞表征并将组织学染色与DNA荧光原位杂交（FISH）相结合。成像质谱仪（IMC）是质谱仪的一种扩展，类似于IHC和质谱仪相结合。IMC用激光激活产生粒子，通过气体将粒子带到质谱流式细胞仪并在载玻片上生成高分辨率图像。IMC保留了抗原特异性并同时提供了32种蛋白质的空间分辨率。此外，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱流式细胞仪可以直接识别蛋白质、脂质、代谢物和药物的分布，准确性和灵敏度更高。成熟后阶段：空间转录组学。随着测序规模和样本数量的增加以及成本的降低，后基因组时代开启。如何将高分辨率空间信息和单细胞表达数据相关联以及将单细胞测序技术表征空间结构一直是一个难题。空间转录组学的出现就解决了这一难题。类似于空间转录组学，slide-seq和高分辨率空间转录组（HDST），利用载玻片上的单层空间barcode珠子捕获组织中释放的mRNA。ZipSeq可以使用特定模式照明和光笼寡核苷酸将DNA编码标记到完整组织的活细胞上，为后续单细胞组学数据记录细胞位置信息。将scRNA-seq数据和原位杂交模式作为输入，Seurat可以推断单细胞的原始空间位置。R包Seurat可以准确定位细胞亚群并以应用与斑马鱼中。Andersson等人基于概率模型方法，该方法对表达谱反卷积以整合scRNA-seq和空间转录组数据并在空间上映射细胞类型。单细胞空间转录组学正在快速发展，但是大多数方法并没有在单细胞水平研究空间结构，这些技术仍然是对较小的细胞混合物进行批量分析。因此，今后的研究仍然致力于开发更多的单细胞技术和相关的测试研究。3.免疫组学和AI随着计算机技术的发展，人工智能已经广泛应用于各个领域。在医学领域，研究人员将机器学习和深度学习应用于疾病诊断，预后和治疗反应预测等方面。在肿瘤免疫方面，人功能呢可以辅助临床医生更好的分析与TIME有关的肿瘤免疫学特征和对免疫治疗的反应。人工智能在癌症免疫研究中的应用主要分为以下几个方面：识别病理切片；识别免疫细胞亚群和空间结构；预测患者TIME的特征和对免疫治疗反应。3.1使用深度学习预测肿瘤抗原准确预测肿瘤抗原对研究和开发个性化肿瘤疫苗十分重要。然而假阳性较高是一个比较重要的问题。目前，预测抗原呈递的工具大多是通过体外结合亲和力数据训练的，而忽略了基因表达和抗原加工相关的转运蛋白。预测肿瘤抗原的第一步是预测异常肽，除了已有的识别SNV的多种算法外，近开发的CN-learn工具可以识别CNV且性能较好。Bulik等人使用来自各个癌症类型的HLA类型和HLA肽训练了深度学习模型EDGE，可用于NSCLC患者的HLA分型。基于深度学习的方法MARIA和MixMHC2pred可以提高MHC-Ⅱ的预测精度。3.2肿瘤免疫中的放射组学随着人工智能在医学影像学中的发展，影像学已经不是简单的而是海量的数字数据。从感兴趣区域（ROI）中提取和定量和定性特征表征肿瘤生物学行为并且可以与临床结果相关联。这种使用人工智能技术分析成像数据的过程就是放射组学。肿瘤免疫的放射组学技术主要用于识别反应免疫浸润的生物标志物并预测ICB治疗患者的治疗反应（图6）。图6放射组学和肿瘤免疫的计算病理学首先，放射组学提供了一种评估免疫相关生物标志物的方法。例如，使用深度学习和FDG-PET预测溶细胞活性打分（CytAct），使用放射组学预测胃癌免疫打分。基于肿瘤突变负荷放射组学标志物（TMBRB）可以将NSCLC患者分为不同临床结局和不同TMB分组，且优于其他临床模型。其次，MOSCATO使用患者的图像相关特征和RNA-seq数据作为训练集，其中使用的放射组学特征是预测免疫治疗反应的生物标志物，可以准确预测免疫治疗反应和总生存期。在ICB管理中，有一些非常规反应。其中一种是超进展（HP），代表开始免疫治疗后的意外加速进展。由于其预后不良，急需预测免疫治疗反应的生物标志物。另一种是假性进展，为开始治疗后肿瘤大小增加和新病变产生。目前，可以通过单独或组合血液，体积和放射组学模型，结合血液生物标志物LDH和放射组学方法预测假性进展。总的来说，放射组学可以在早期阶段识别肿瘤的变化，对患者对免疫治疗敏感性进行分层并通过非侵入性方法预测其临床结果。然而，目前的研究都是回顾性研究，还需要大量的数据和前瞻性研究进行验证。3.3肿瘤免疫的计算病理学与放射组学相比，病理学主要从更加微观的角度识别组织学的改变。HE染色，IHC和IF辅助病理学家区分不同的细胞亚群。病理学的人工智能即数字病理学，通过计算分析探索免疫细胞和肿瘤细胞的互作和癌症生物学关键行为之间的联系提供新的见解。基于CNN的深度学习模型可以研究HE染色和IHC染色载玻片上肿瘤浸润免疫细胞的浸润水平和空间分布。AbdulJabbar等人开发了深度学习框架描述TIME的空间结构，揭示同一患者的不同样本中的免疫细胞浸润异质性。此外，进化模式，克隆新抗原和抗原呈递与TIL分布与TIME的空间复杂性有关。结合免疫细胞组成和空间组织的预测模型与癌症预后有关（图3）。与放射组学类似，数字病理学与深度学习结合可以从图像中挖掘有价值的信息。然而数字病理学可以从细胞或分子水平了解TIME。与高维成像技术IMC和MIBI-TOF一致，数字病理学可以作为一种研究TIME结合和癌症生物学与治疗反应的相关性的有价值的方法。数字病理学主要采用深度学习方法来解析空间架构，可以提供更详细的免疫信息。因此放射组学和数字病理学对免疫微环境研究十分重要。4.结论和未来方向随着免疫组学领域新兴技术的发展，研究人员可以深度剖析肿瘤免疫（图7）。本篇文章作者展示了肿瘤免疫学中传统和先进的技术以及临床应用的前景。图7免疫组学蓝图：发展趋势和未来方向在bulk测序时代，评估肿瘤免疫细胞的方法主要包括CIBERSORT和MCP-counter可以辅助研究肿瘤免疫细胞的个体浸润模式。此外，预测异常肽，HLA分型和预测肿瘤抗原-MHC结合亲和力已经应用于临床研究中。由于免疫细胞亚型和ITH的高度多样性，单细胞水平上研究肿瘤免疫十分重要。随着单细胞免疫相关技术的发展，从流式细胞仪和光谱流式细胞仪到CyTOF，单细胞肿瘤免疫图谱有助于免疫细胞亚群分类。在空间结构研究中，HE，IHC/IF，MIBI/TOF和空间分辨率转录组可以提高TIME的分辨率。人工智能的出现为免疫组学提供了新的方向。放射组学和病理学图像数据结合深度学习深入研究TIME可以为预测预后和免疫治疗反应提供了临床信息。随着免疫组学技术的蓬勃发展，还需要考虑以下几个问题。第一，尽管已经有了许多用于质控和数据分析的方法，但是这些方法的效果还有进一步改进的空间。第二，期望出现成本低，经济高效和自动化的技术。第三，期望研究人员充分利用现有技术研究中路免疫并促进临床转化。第四，期望开发针对特定癌症类型的技术。尽管还有很多工作需要进行，但是免疫组学在未来的肿瘤免疫学领域将占主导地位，其临床价值会极大的推动免疫组学在免疫基因组学，单细胞和人工智能领域的发展。 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