运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建

运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是一种在微生物发酵工程中非常具有前景的底盘细胞。为了在运动发酵单胞菌内实现外源基因表达的严谨调控，本团队构建了由四环素（Tetracycline, Tc）与阿拉伯糖（Arabinose, Ara）共同诱导的T7 RNA聚合酶，以及含有T7启动子的pTZ系列穿梭表达质粒（运动发酵单胞菌-大肠杆菌），成功建立了表达效率高、正交性强的T7表达系统，我们也利用该系统测试了数种外源蛋白的表达水平。

同时，我们选取具备自动分泌特性的超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP, superfold GFP)测试其在运动发酵单胞菌的分泌能力，可以与上述建立的系统实现异源蛋白的高效表达与一步分泌。

项目背景

基因表达调控是一个具有多层次性和复杂性的过程，包括基因水平、转录水平、转录后水平和翻译水平等多个层次。对于原核生物而言，其调控表达系统诱导过程缓慢、效率低，缺乏诱导特异性和表达的精确调控等，限制了表达系统的应用。故而期望出现更丰富的基因严谨调控系统，使基因的时空表达受到高效的严谨控制，有效使用细胞的资源。 运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌，是目前已知通过Entner-Doudoroff（ED）途径进行厌氧发酵的微生物，具有基因组小，乙醇产率高，耐受高糖、高酒精，生长温度（24～45℃）和pH（4.0～8.0）范围广泛等优良特性。由于运动发酵单胞菌的这些特性，使得它在工业化生产上具有广阔的应用前景。近年来也有针对运动发酵单胞菌开展的大量系统与合成生物学、基因工程与代谢工程等方面的研究成果。

大肠杆菌中高效表达的T7 RNA聚合酶（T7 RNAP, T7P）系统已有报道，我们尝试在运动发酵单胞菌中设计类似的高效表达系统，用于严谨调控线路的构建，帮助解析有毒基因的功能及实现代谢途径在运动发酵单胞菌中的严谨调控；同时也将构建可以在运动发酵单胞菌与大肠杆菌中使用的穿梭质粒，方便质粒的构建及提高外源基因在运动发酵单胞菌中的表达效率，为后续蛋白的表达与分泌及代谢工程途径优化调控奠定基础。

项目技术线

通过构建四环素与阿拉伯糖共同诱导表达T7 RNA聚合酶的穿梭载体，实现具有强正交性T7表达系统在运动发酵单胞菌中的建立：T7 RNAP具备一定的毒性，所以对其表达进行调控：T7 RNAP由启动子PBAD控制，同时AraC的表达又受到Ptet调控。在没有添加阿拉伯糖诱导物的条件下，目的蛋白GFP没有表达或者表达量很低；在四环素和阿拉伯糖两种诱导物同时存在的时候蛋白表达量高。     基于pET系列质粒，通过添加运动发酵单胞菌的复制子构建有 PT7 驱动的外源基因表达的pTZ系列质粒：后续可以将带有待表达蛋白基因的穿梭表达质粒pTZ转入已建立T7表达系统的运动发酵单胞菌中，实现基因与线路的严谨调控与蛋白的高效表达。

主要成果

►设计T7 RNA聚合酶表达质粒并构建转化菌株。

►检验双质粒系统蛋白表达效果。

我们选用绿色荧光蛋白GFP作为报告蛋白，相应的基因克隆到含有PT7启动子的pTZ22b和pTZ28a空载体上；同时将该基因克隆到不含PT7启动子的pEZ15A空载体上作为对照组。将含上述报告基因的3种质粒分别转化到重组菌株ZM-1（p39-Ptet-AraC-PBAD-T7P）中。

得到的转化菌株都含有T7 RNA聚合酶质粒和报告基因质粒。

我们采用流式细胞仪检测不同菌株内GFP的荧光强度。实验结果表明，在不同浓度梯度的四环素（Tc）、阿拉伯糖（Ara）诱导下，PT7驱动的表达质粒pTZ22b-GFP、pTZ28a-GFP能够响应Tc或Ara的诱导，且具有剂量依赖性；而不含PT7的对照质粒pEZ15A-GFP不受到Tc或Ara的诱导调控。

用0.8 μg/mL的四环素和3 mg/mL阿拉伯糖组合进行诱导时，报告基因的荧光值高。可见，双质粒系统确实可以实现目标基因的严谨控制，并且也初步实现了外源基因的大量表。

►分泌蛋白的检验。

选取3个GFP突变株：sfGFP7、sfGFP15、GFP-high，将以上3个基因克隆到pEZ15A空载体上，并分别转化到运动发酵单胞菌中，测试其单在运动发酵单胞菌内单独表达时的表达量以及分泌能力。

通过Western Blot检测不同的GFP在运动发酵单胞菌中的分泌情况：将3个得到的转化菌株菌培养到对数期后，取定量的上清进行检测。

我们采用流式细胞仪检测3个GFP突变株的荧光强度，同时，取定量上清通过Western Blot检测不同的突变体的分泌情况。结果表明，突变株GFP-high的总体荧光强度低于另外两突变株，上清中也未得到相应荧光蛋白，而突变株sfGFP7及突变株sfGFP15在运动发酵单胞菌中的表达量及分泌能力远远高于突变株GFP-high，其中突变株sfGFP15的荧光强度高，且分泌能力强。

后续实验将以上述GFP为载体，从多肽到异源的复合蛋白，分别与其进行融合表达，确定其是否具备携带融合蛋白自动分泌的特性；除了促进细胞外分泌，也需确定sfGFP融合蛋白是否可以正确折叠成活性复合蛋白结构。