ADC之蛋白酶可裂解连接子

蛋白酶可裂解连接子是ADC中应用广泛的连接子。目前已有使用该类型连接子的多个ADC药物获得批准，应用于治疗实体瘤和血液瘤。本文就一些蛋白酶连接子的开发做一个简单介绍。

组织蛋白酶B可切割连接子

组织蛋白酶B可切割Val-Cit连接子

鉴于为癌症治疗而开发的ADC，人们一直关注那些在肿瘤中过表达的组织蛋白酶，特别是组织蛋白酶B，因为它在哺乳动物细胞的溶酶体中含量很高。从已知的苯丙氨酸-精氨酸(Phe-Arg)二肽底物序列开始， BMS的科学家们研究了一系列封端的二肽前药，通过二肽的羧基连接到DOX的氨基上，以被组织蛋白酶B切割，并在人体血浆中保持稳定。由于DOX被认为太大，不适合组织蛋白酶B的活性部位，研究者加入了对氨基苯氧羰基(PABC)间隔区，用于酰胺键的酶促裂解时的自焚碎裂和药物释放。

后续的研究发现在用于MMAE连接的不同组织蛋白酶B可切割连接子中，带有Val Cit-PABC连接子的ADC在效价、特异性、血浆稳定性和体内药效方面表现出佳的性能。这些发现为进入临床研究的第二代ADC的开发提供了基础，并导致几种ADC药物获得成功批准，包括血液肿瘤和实体肿瘤。Brentuximab vedotin (Adcetris)是一种以Val-Cit-PABC接头和MMAE为有效载荷的抗CD30 ADC，被批准用于表达CD30的复发性霍奇金淋巴瘤、全身性间变性大细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤。在批准用于弥漫性大B细胞淋巴瘤的抗CD79b-Val-Cit-PABC-MMAE ADC(polatuzumab vedotin，Polivy)中使用了相同的接头和有效载荷设计，并与苯达莫司汀和利妥昔单抗联合使用。抗Nectin-4 Val-Cit PABC-MMAE ADC(enfortomab vedotin，Padcevs)也含有相同的连接子，并已被批准用于转移性尿路上皮癌。抗组织因子(TF) Val-Cit-PABC-MMAE ADC （tisotumab vedotin），被批准用于宫颈癌。

Val-Cit-PABC-MMAE ADC的有效载荷过早释放

2011年，由Seagen开发的第一个ADC Adcetriss成功获得批准后，研究者对组织蛋白酶可切割的Val-Cit-PABC接头进行了更详细的研究。在早期的研究中，组织蛋白酶可切割的cBR96 ADC在人血浆中具有很高的稳定性(Val-Cit 的半衰期为 230 天，Phe-Lys的半衰期为 80 天)。然而，在小鼠血浆中发现稳定性较低(Val-Cit的半衰期为30天，Phe-Lys的半衰期为12.5天)。这种不稳定性在活体小鼠模型中更加明显，但在猴子或人类身上尚未见过。对各种酶抑制剂的广泛研究、蛋白质组学研究以及对基因敲除小鼠的研究表明，小鼠血浆中过早释放有效载荷相关的Val-Cit连接子不稳定的原因是羧酸酯酶1c(Ces1c)，而不是组织蛋白酶B。

科学家对Ces1c结合位点的更深入研究揭示了一条改进切割序列的设计。Ces1c的催化部位在一个狭窄的口袋深处，而组织蛋白酶B的活性部位在一个较浅的口袋。若ADC的切割序列与P3氨基末端的极性氨基酸的延长则可以消除Ces1c由于活性部位不可及而被Ces1c切割，而组织蛋白酶B的切割完全保留。当使用谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸时，这种影响为明显，这表明负电荷有效地排斥了Ces1c酶。在HER2阳性的KPL-4和JIMT-1乳腺癌移植小鼠模型中，与Val-Cit连接子HER2-ADC相比，Glu-Val-Cit连接子ADC增强了小鼠的血浆稳定性，提高了JIMT-1乳腺癌移植模型的体内药效。

在另一种提高组织蛋白酶B可切割ADC的血浆稳定性的方法中，研究了修饰自焚间隔基部分的影响，这些努力导致了me[x]ta-amide PABC基团的鉴定，该基团产生了具有改善的小鼠血清稳定性的连接子。如果在mata部位使用聚乙二醇组分，还可以降低疏水性，而不会对组织蛋白酶B所需的蛋白水解性切割产生负面影响。 Agensys的研究人员调查了引起中性粒细胞减少的潜在原因，这是癌症患者的一种常见不良事件。研究发现，具有释放MMAE有效载荷的可切割Val-Cit-PABC连接子的ADC会在不依赖抗体和靶点的情况下导致患者中性粒细胞减少，而接受MMAF通过非切割马来胺异丙基连接子(mc-MMAF)治疗的ADC患者中性粒细胞减少并不明显。因此，研究者研究了带有可切割连接子的ADC(vc-PABC-MMAE)释放具有旁观者效应的有效载荷和具有不可切割连接子的ADC(mc-MMAF)释放没有旁观者影响的有效载荷对中性粒细胞分化的影响。所调查的ADC针对的是中性粒细胞上未表达的抗原，如ENPP3、SLC44A4。研究发现可切割的vc-PABC-MMAE ADC对分化为中性粒细胞的HSCs的细胞毒作用强于与相同的抗体通过不可切割的mc-MMAF有效载荷连接的ADC。这归因于中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对可切割的Val-Cit连接子进行胞外裂解，随后释放出游离的MMAE有效载荷，由于其旁观者效应，对中性粒细胞是有毒的。vc-PABC-MMAE的切割可被丝氨酸蛋白酶抑制剂阻断，但不能被半胱氨酸蛋白酶抑制剂阻断。综上所述，中性粒细胞分化所分泌的丝氨酸蛋白酶能够在循环中释放细胞通透性的MMAE，对中性粒细胞具有细胞毒作用，从而可能导致这种Val-Cit-PABC-MMAE ADC引起的中性粒细胞减少症。 这些发现可能为增加可切割ADC的治疗窗口提供机会，方法是设计对某些溶酶体半胱氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶B)而不是丝氨酸蛋白酶(如中性粒细胞弹性蛋白酶)具有更高特异性的连接子。

组织蛋白酶B背后隐藏的切割力量

Genentech的研究人员阐明了在使用同向异构体和基因敲除小鼠时，Val-Cit-PABC-MMAE ADCs分解代谢和代谢物形成的其他机制。 在HER2阳性的KPL-4细胞中通过CRISPR/Cas9介导的组织蛋白B基因的缺失或在CD22阳性的淋巴瘤细胞系WSU-DLCL2和BJAB中通过shRNA敲除来抑制组织蛋白酶B的表达，但这对抗HER2或抗CD22 Val-Cit-PABC-MMAE ADCs的疗效没有影响。这是一个明确的暗示，其他酶可以补偿组织蛋白酶B活性的损失，以释放MMAE。用纯化的组织蛋白酶B、K、L和S进行生化切割分析表明，不仅组织蛋白酶B而且组织蛋白酶S也能有效地切割Val-Cit-PABC-MMAE ADC。

组织蛋白酶B特异性切割的ADC设计

由于含有Val-Cit多肽连接子易被多种酶如组织蛋白酶B、组织蛋白酶S、Ces1c和中性粒细胞弹性蛋白酶切割，Genentech和Spigen的研究人员致力于提高该多肽连接子对组织蛋白酶B切割的特异性。 通过采用结构驱动的方法来开发组织蛋白B高特异性切割的模拟肽连接子，他们从组织蛋白酶B活性部位的半胱氨酸残基Cys-29共价结合的二肽基腈抑制剂的结构信息和一个简化的模型系统出发，提出了一种含有环丁烷-1，1-二甲酰胺(cBU)部分的具有所需性质的模拟肽连接子。这种含cBU-Cit的ADC的胞内切割被组织蛋白酶B抑制剂特异性抑制75%，被广谱蛋白酶抑制剂抑制90%。相反，含有Val-Cit的ADC的切割只能用广谱的蛋白酶抑制剂来抑制。因此， cBU-Cit部分对组织蛋白酶B的切割更具特异性。
 

四肽连接子Gly-Gly-Phe-Gly

继Kadcyla (ado-trastuzumab emtansine，T-DM1)在2013年获得批准后，研究者进行了其他的尝试，以探索具有不同连接子和不同有效载荷的曲妥珠单抗ADC。其中具有代表性的下一代HER2 ADC是trastuzumab deruxtecan DS-8201a (Enhertus)，由DNA拓扑异构酶I抑制剂deruxtecan(DXd) 通过蛋白酶可切割接头连接到HER2 mAb。该ADC通过马来酰亚胺丙基构建块连接到抗体的四个链间二硫键还原后的半胱氨酸残基上，导致DAR为7.7。其应用的连接子由Gly-Gly-Phe-Gly部分和自焚的氨基-甲氧基间隔基组成。四肽连接子可以被组织蛋白酶B和L切割，然后自焚氨基以释放活性有效载荷DXd。体外和体内研究表明，DS-8201a在血浆中具有很高的稳定性。DS-8201a已被FDA批准用于治疗无法手术或转移性乳腺癌的成年患者以及用于治疗HER2阳性的转移性胃癌患者。
Legumain（LGMN）可裂解连接子  
LGMN，是半胱氨酸蛋白酶家族的成员，在豆科植物种子中发现。1997年，LGMN也从哺乳动物中被克隆出来。它首先表达为pro-LGMN，然后经历pH依赖的自我催化，产生活性的LGMN内肽酶。酸性的pH对于LGMN酶的活性是必不可少的。LGMN 主要定位于内体溶酶体区室和溶酶体，两者都具有所需的酸性 pH 值，但在细胞外空间也检测到 LGMN。由于TME是以酸性pH为特征的，因此LGMN可能既有细胞活性，又有一定的细胞外活性。LGMN是已知的一种在ASN残留后特异性切割的哺乳动物蛋白酶。基于免疫组织化学数据，LGMN已被证明在多种肿瘤类型中过度表达，例如在肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中。 拜耳公司的科学家开发了一种新的连接技术，利用与肿瘤相关的溶酶体蛋白水解酶LGMN作为切割酶，用于ADC。
研究者设想，在肿瘤中的过度表达和天冬酰胺后高度选择性的切割位点可以提高肿瘤的特异性，从而增加ADC的治疗窗口。 研究发现LGMN也可以在肿瘤间质中的细胞外切割，但由于LGMN活性的适pH约为4.5-5.5，因此在肿瘤间质中的药物释放是次优的。较高的LGMN丰度，以及溶酶体内的酸性pH，为LGMN的活性提供了的环境，确实可以显示出高效的药物释放。 Lerchenet等人研究了ADC以及具有不同肽连接子的小分子化合物作为潜在的LGMN底物。首先，Lerchenet等人探索了具有已知LGMN底物序列丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(ALA-ALA-ASN)的ADC，该序列显示出对靶向表达的癌细胞株的高活性。
为了避免非LGMN介导的切割，例如在连接子中的丙氨酸残基之后，中心丙氨酸残基被非天然的D-丙氨酸或N-methyl丙氨酸取代。这两种ADC的体外活性与由氨基酸组成的ADC活性相似。甚至完全去除ALA-ALA二肽也是可以接受的。而且研究发现这种新型ADC对组织蛋白酶B和中性粒细胞弹性蛋白酶具有较高的稳定性。

ADC的胞外激活连接子  

细胞外组织蛋白酶可裂解的ADC

为了探索非内化抗原是否可以用来靶向TME或肿瘤内皮细胞, 已选择高度特异性表达的非内化肿瘤抗原, 例如Tenascin剪接变异体、CD21。 Gebleuxet等人使用了针对非内化抗原tenascin的剪接异构体tenascin-C的F16抗体 ADC。在皮下移植的A431(人表皮样癌)和U87(人胃癌)异种小鼠模型中，F16-Val-Cit-PABC-MMAE在这两个模型中都产生了CR。Ex vivo显微镜分析显示，抗体F16优先富含抗原(Tenascin-C)的肿瘤内皮下细胞外基质。 用含有Val-Cit-PABC-MMAF的ADC靶向内化能力很差的抗原CD21在临床前淋巴瘤模型没有杀伤效果，而同一抗体与Val-Cit-PABC-MMAE的偶联则显示出很强的抗肿瘤活性。这表明，不依赖通过抗原结合内化的细胞外组织蛋白酶切割机制也正在发挥着作用。
 

基质金属蛋白酶

描述了一种双标记ADC，能够通过不同的切割机制释放两种不同的荧光标记：一种结合物含有可被细胞外基质金属蛋白酶2(MMP2)切割的肽序列Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly，另一种结合物包含经典的Val-Cit-PABC连接子，它可以被组织蛋白酶B切割。已在可被不同MMP切割的多肽的筛选中鉴定了MMP-2切割序列Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly。由于Val-Cit-PABC已成功应用于几个批准并上市的ADC，而Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly连接子迄今仅用于聚合物药物结合物。我们相信可被胞外MMP-2切割的序列有望用于ADC连接子的重要组成部分。
小  结  
蛋白酶可裂解连接子已成功用于ADC的药物开发。组织蛋白酶可裂解连接子是目前应用广泛以及研究深入的。对组织蛋白酶切割机制的广泛研究使人们更好地了解了切割生物学和连接子的设计。由于稳定性和特异性的增加，可能导致治疗窗口的增强。为了促进肿瘤特异性有效载荷释放，天冬酰胺后具有独特切割序列的肿瘤相关蛋白酶LGMN也已经被探索，相关的ADC也正在开发中。针对肿瘤微环境中蛋白酶切割的连接子也在开发中，也许通过利用肿瘤微环境的特性激活ADC，可以增强ADC的肿瘤选择性以及发挥更大的药效。总而言之，蛋白酶可裂解连接子的发展已经逐渐成熟，这为ADC的成功奠定了重要基础。