解剖学促进人体皮肤微生物群中菌株的中性共存

本文研究了宿主解剖学是否可以解释痤疮杆菌(Cutibacterium acnes)的菌株共存，这是人类皮肤上丰富的菌种。本研究利用从健康受试者皮肤上(包括单个皮肤毛孔)获得的痤疮杆菌菌落的全基因组测序，重建其在个体身上的进化和迁移，并在毛孔水平上发现了相当大的空间结构。尽管在厘米尺度的区域内，具有体外适应度差异的谱系(由<100个突变分隔的菌落)共存，但每个毛孔都由一个单一谱系主导。

此外，来自一个毛孔的菌落通常具有相同的基因组。自适应特征的缺失表明，毛孔内多样性低的来源与基因型无关。因此，我们认为毛孔解剖会加强随机单细胞瓶颈；由此产生的种群分散减少了竞争并促进了共存。

本研究结果表明，涉及毛孔栖息物种的治疗干预可能侧重于消除常驻菌群，而不是优化益生菌的适应性。  

结果

1 以前所未有的空间和遗传分辨率研究痤疮杆菌的生物地理学

为了获取健康人群皮脂腺皮肤上痤疮杆菌(C. acnes)的生物地理学特征，我们收集了多个长度尺度的样本(图1A)。在精细的尺度上，我们使用粉刺提取器和毛孔条(毛孔样本；STAR方法)从单个皮脂腺毛囊(被认为大多数痤疮杆菌生长的地方)收集材料。

我们顺便收集了来自多个相邻毛囊的材料样本(多孔样本)。此外，我们在一个更粗糙的空间尺度上(前额、鼻子、左/右脸颊、下巴、肩膀、后背区域)收集样本，通过使用长牙签在较大的皮脂腺区域来回刮取(刮取样本；STAR方法)。共收集了来自16名健康成年人的300个样本。这包括来自其中5名受试者的145个毛孔样本，其中两个是使用毛孔条精细取样的。

取样后，我们立即将收集的材料划线到固体培养基上，并在有利于痤疮杆菌生长的厌氧环境中培养(见STAR方法)。我们在每个样本中随机选择1-15个菌落形态与痤疮杆菌一致的菌落进行全基因组测序。共获得了947个通过纯度和覆盖率过滤器(STAR方法)的高质量基因组。

2 个体的痤疮杆菌群落源于多次定植事件 

首先根据已建立的分型方案对菌落进行分类；我们数据集中代表的6种菌株类型涵盖了大多数已知的痤疮杆菌多样性。与之前的工作一致，我们发现多种痤疮杆菌菌株类型通常存在于一个个体身上。值得注意的是，菌株类型的系统发育分布因人而异(图2A)。 为了评估相同菌株类型的菌落是否可能源自独立的定植事件，我们使用基于参考的方法量化基因组差异，并专注于SNV。这种方法捕获了绝大多数种内变异，因为痤疮杆菌有一个小的附属基因组(菌株类型之间的变异约为10%)，主要由基因组岛组成，其存在和缺失的模式与核心基因组系统发育相对。 

本研究发现来自同一个体(而并非不同个体)的菌落通常非常密切相关，这表明存在个体特异性种群。这种差异表明密切相关的菌落来自于该个体的祖先出现的个体多样化。因此，我们根据遗传距离将菌落聚类成谱系，产生了53个谱系，每个谱系仅包含来自一个受试者的菌落。来自同一谱系的菌落在其核心基因组中被不到100个SNV分离。因为我们规定了3个菌落的小谱系大小，所以一些菌落不属于任何谱系；这些代表来自外部环境的低丰度基因型或短暂的非驻留基因型。 将菌落聚集成谱系使我们能够估计每个个体的定植事件数量。

每个谱系可能代表一个特定的定植事件，或者，如果一个个体被多个密切相关的基因型定植(例如，来自父母谱系的多个基因型转移给孩子)，则一个谱系可能反映多个定植事件。因此，在一个个体身上检测到的痤疮杆菌谱系的数量代表了成功定植在一个人身上的痤疮杆菌基因型的低数量。我们注意到，我们低估了许多受试者的谱系共存性，因为大多数受试者没有进行详尽地抽样。

有趣的是，我们经常在单个受试者身上检测到相同菌株类型的多个谱系，这表明单个宿主可以多次被相同菌株类型定植。在极端的情况下，个体2被来自6种菌株类型的至少9种不同谱系定植。 正如文献所预期的那样，谱系之间移动基因含量的差异与核心基因组差异密切相关。因此，我们发现许多具有相似基因含量的谱系在一个个体上共存，这表明基因含量的差异不能解释其共存。

此外，我们没有发现个体上的聚合基因含量比随机绘制谱系所预期的要高，这表明功能差异并不是谱系共存的重要因素。在谱系中，我们发现很少有基因含量变异的情况，表明基因获得和丢失的速度相对较慢。质粒构成了谱系内大部分可移动基因含量变化，有23%的菌落具有质粒的证据。

3 痤疮杆菌菌株类型的共存并非源于解剖生态位的特异性 

为了测试菌株类型是否因为具有同等竞争力而共存，我们测量了它们在体外的生长速率。即使在简单的实验室条件下，我们也注意到来自同一个体的菌落之间存在差异。我们评估了受试者1和受试者2(采样密集的受试者)上来自丰富谱系的25个菌落的生长速率，它们代表了不同的菌株类型，并从同一时间点进行培养。我们发现生长速率可能有很大差异(对于两个受试者，ANOVA，p < 10-3)，在菌落之间变化高达80%，并且在谱系内部和谱系之间都有明显的变化。因此，我们试图确定是什么使具有不同竞争能力的痤疮杆菌菌株类型能够在体内共存。

不同痤疮杆菌菌株类型的稳定共存可能源于生态位特化和解剖学特征。尤其是就氧气浓度、营养供应和其他因素而言，皮肤表面的环境与皮肤毛孔内部的环境存在差异。因此，我们寻找直接从毛孔的毛囊(毛孔提取物和毛孔条样品)取样与在皮肤表面取样(刮擦样品)之间的菌株类型差异。然而，我们没有观察到受试者1或其他受试者的皮肤表面与皮肤毛孔的菌株类型排他性。这表明痤疮杆菌菌株类型并非专门针对毛孔或皮肤表面环境。

接下来，我们探讨了某些菌株类型更适合特定皮肤区域(例如，鼻子与前额)的可能性。不同的菌株类型在受试者1的面部皮肤区域内紧密共存。这种模式适用于受试者，其中菌种类型广泛存在于面部皮肤区域，而不是仅存在于某些区域中。面部区域缺乏排他性与之前的宏基因组和基于培养的研究一致。然而，一些受试者的面部和背部之间的痤疮杆菌菌株类型存在的组成差异，这种模式在公开的宏基因组数据中也很明显。有趣的是，我们发现面部和背部的菌株类型没有一致性。这种缺乏一致性的情况不利于“背部适应”或“面部适应”的菌株类型，相反，它暗示了中性力量，例如有限的迁移或优先效应(有利于早期定植菌而不是新定植的力量)。总之，这些发现支持了一个模型，即痤疮杆菌菌株类型并不专门针对特定的解剖区域。

4 每个皮肤毛孔仅由一个谱系支配 

解剖学特征的生态位特化的缺乏提出了一个问题，即皮肤环境如何防止菌株类型相互竞争。我们接下来研究了精细尺度的空间分辨率，重点关注谱系水平和从毛孔毛囊(毛孔条和毛孔提取物)获得的样本。在单个毛孔的水平上，观察到明显缺乏多样性。通过仔细检查受试者1和3，我们可以清楚地看到这一点，我们从中采样了多数量的毛孔。如果基因型随机分布在毛孔中，则源自毛孔的成对菌落属于同一谱系的比率高于预期。值得注意的是，在密集的采样毛孔中，11个菌落来自同一谱系。即使毛孔间隔很近，这种分离仍然存在：在来自受试者3的毛孔条的1平方厘米部分中，我们发现了3个不同的谱系，尽管每个毛孔只包含1个谱系。我们偶尔会从毛孔样本中检测到少数谱系但我们无法确定它们是否反映了真正的少数群体、皮脂丝内的分化或表面污染。 尽管毛孔内多样性低可能源于仅捕获了部分毛囊样本，但我们注意到，以前使用光学显微镜对黑头提取后的皮肤活检进行成像，表明提取能够去除大部分毛囊内容物。 

5 中性瓶颈导致毛孔的单一定植 

皮肤毛孔中痤疮杆菌谱系的空间分离可能来自优先效应或由宿主或其他微生物形成的毛孔特异性选择。我们推断，当在全基因组水平上检查时，这些机制会导致不同程度的毛孔内多样性，以及不同的适应性进化信号。通过优先效应或毛孔内的自适应扫描进行排除将导致每个毛孔内的单一基因型，而对特定谱系成员的选择有时会导致同一谱系的不同迁移者共存。 

在个体SNV的水平上，我们发现痤疮杆菌毛孔内多样性缺乏，来自同一毛孔的菌落在系统发育上紧密聚集在一起。来自同一毛孔的菌落通常形成单系进化枝，并且在某些情况下，会有其他地方检测不到的突变或罕见的质粒变体。此外，毛孔内多样性的指标相对于每个谱系的总多样性极低，这是通过与各种推断的共同祖先(MRCA)的遗传距离来评估的。来自单个毛孔样本的谱系1a(受试者1中大的谱系)的菌落其毛孔内MRCA突变平均少于1个，而来自该谱系的成对毛孔其孔内MRCA突变通常为4-8.5个(25%-75%百分位)。这种在和相对尺度上毛孔内多样性极低的模式在谱系和受试者之间是一致的尽管痤疮杆菌的分子时钟速率未知且我们无法准确测量，但所有报告的来自人类感染或定植的细菌分子时钟范围在0.5个SNV/基因组/年和30个SNV/基因组/年之间。因此，我们对低毛孔内多样性的观察表明每个毛孔内的种群通常在大约1年前从单个细胞下降，并暗示优先效应可能对于排除其他菌株类型很重要。 

在1a谱系中有两个毛孔样本与谱系MRCA进一步分离(45和56个SNVs，而平均为9个SNVs；Grubbs离群检验)，并显示有更多的毛孔内多样性。我们怀疑这种过剩的多样性可能是由于超突变造成的，这种加速突变在实验室实验和体内实验中很常见，通常由DNA修复缺陷引起。与这一假设一致，这些菌落共享一种突变，消除了nucS基因的起始密码子，该基因编码的内切酶对修复过渡突变至关重要。事实上，我们观察到，在超突变体支系中，过渡性突变与转基因突变的比例有所增加(图S6)。这一发现表明，这些毛孔在生理上与其他毛孔相似，而突变率的增加使痤疮杆菌在单细胞祖先和采样之间积累了更多的多样性。有趣的是，我们只在受试者1的5个采样时间点中的第一个采样点恢复了带有nucS突变的菌落，这表明这种超突变不太可能与对该宿主的长期适应有关。同样，我们没有观察到任何其他具有超突变证据的受试者谱系。 

鉴于单个毛孔平均含有50,000个痤疮杆菌菌落形成单位发现每个毛孔都有一个单细胞祖先，这尤其令人惊讶。如此庞大的种群规模通常会限制中性遗传漂变的速度；中性进化的经典模型预测，一个中性突变需要超过10万个细菌世代(在这种情况下，可能需要数百年)才能席卷如此规模的种群。因此，我们的观察表明，要么存在增强遗传漂变的条件，要么存在快速清除多样性的适应性突变扫描。 为了测试自适应扫描是否可能负责清除毛孔内的多样性，我们检查了谱系内突变以寻找过去适应的证据。平行进化是细菌适应的一个常见标志，表现为相对于中性模型在选择下基因或途径突变的富集。然而，在编码区域的所有2,445个从头突变中、在一个受试者身上发生的突变中、在一个谱系内发生的突变中或毛孔内突变中都没有发现平行进化的情况。此外，我们发现在所有从头突变中，存在非同义(氨基酸变化)突变的缺失。

重要的是，dN/dS的比率与基因突变的次数、推断的突变年龄或所考虑的功能通路无关。自适应信号的缺失说明选择性扫描不是毛孔内瓶颈的驱动因素。此外，基因含量变化的速度对于瓶颈由适应性基因获得或损失驱动的模型而言过于缓慢。相反，我们提出毛孔内遗传多样性低是由于毛孔解剖学和生理学引起的频繁的中性种群瓶颈

6 毛孔解剖学和生理学足以在定植过程中造成瓶颈 

我们接下来研究，这些的种群瓶颈是否在毛孔种群建立很久之后才发生，或者相反，是在迁移到毛孔的过程中发生的。如果毛孔种群长期隔离，则此处观察到的近期瓶颈将仅反映一系列毛孔内瓶颈中的新瓶颈情况；在这种情况下，连续的毛孔内扫描会在每个毛孔的MRCAs之间产生较大的遗传距离。相反，我们发现大多数毛孔在另一个毛孔中具有密切相关的种群，存在许多对毛孔共享SNVs，推测是发生的。这些发现与在毛孔之间传递基因型是一致的。结合我们对毛孔内年轻种群的观察，我们发现毛孔之间的共同祖先支持这样一种模型，即中性瓶颈发生在的毛孔定植或再定植事件中。我们提出毛孔生理学可能造成这样的瓶颈。我们使用已发表的相关生理参数值模拟了毛孔定植过程，并假设大多数痤疮杆菌生长发生在毛孔底部的有利条件下。

首先，由于痤疮杆菌是不动的，它必须依靠生长和扩散才能到达毛孔底部。对细菌细胞在皮脂中的扩散系数和皮脂流速的估计表明，大多数潜在的定植菌被皮脂流动迅速挤出毛囊；一个细胞很少会在毛孔中停留超过一倍的时间。

其次，痤疮杆菌细胞在到达毛孔较深处之前可能无法快速增殖，因为那里的环境是厌氧的，由于皮脂产生，营养丰富。第三，嵌入皮脂中的固体障碍物(包括细菌团和死亡的人体细胞)会进一步减缓扩散，使潜在入侵者更难定植。通过这种方式，毛孔生理学可以使一个幸运的单细胞建立一个毛孔的常驻种群，在毛孔底部的大量生长阻挡了新的细菌移民。尽管一些毛孔MRCA之间的距离很小，但每个谱系的MRCA整体上都明显更古老。这些数据与一个模型一致，在该模型中，在给定的谱系迁移到受试者的皮肤上很久之后才建立毛孔密度。因此，我们认为这些定植事件可能代表潜在群落受到干扰后的毛孔再定植事件，可能由免疫系统、噬菌体捕食或物理清除引起。

7 毛孔被来自远方的痤疮杆菌基因型定植 

为了了解跨毛孔的迁移动态，我们转向了毛孔条数据，其中每个采样的毛孔都定义了空间坐标。在毛孔优先被其邻居定植的情况下，我们预计会看到出现的遗传变异的空间限制。然而，类似于我们之前观察到的，谱系本身并不特定于某些面部皮肤区域，我们发现密切相关的毛孔可以通过较大的物理距离分开。为了定量评估这一点，我们创建了一个空间坐标随机变换的中性模型，并评估具有密切相关基因型的毛孔是否更有可能彼此相邻，而不是随机分布，我们在SNV水平上没有发现空间限制的证据。这一发现表明，新基因型在面部皮肤区域传播的时间尺度比进一步遗传多样化的时间尺度要快。这与痤疮杆菌细胞主要在毛孔内生长并通过远程扩散机制(例如，洗涤或触摸)穿过皮肤转移到新打开的毛孔的模型一致。 

8 皮肤毛孔促进现存痤疮杆菌谱系的共存和稳定 

综上所述，我们的结果支持了这样一个模型，即皮肤毛孔的瓶颈，因此，皮肤解剖学和生理学在痤疮杆菌对人体生态的影响中发挥重要作用。由于严重的空间隔离形成岛状单元，不同毛孔中的痤疮杆菌种群不依赖相同的资源进行生长。细菌几乎没有机会在其他地方竞争，因为皮肤表面的生长极少，并且细菌向表面的迁移受到皮脂流动而不是内在适应性的限制。理论研究提出，空间隔离通过降低生态相互作用的强度来促进中性共存。我们提出，隔离毛孔促进竞争的减少是生态隔离的极端版本，这促进了痤疮杆菌谱系的共存，即使它们具有适应度差异和不同的生存策略。此外，毛孔产生的优先效应可能有助于解释令人惊讶的观察结果，即尽管皮肤暴露于外部世界，但个体的菌种类型会随着时间的推移保持稳定。

首先，毛孔的生理特性使痤疮杆菌种群与外部环境隔离。此外，皮脂流动确保皮肤表面上源自毛孔的痤疮杆菌细胞数量超过源自环境的细胞。因此，已经建立的谱系将更有可能在新的毛孔中定植。更长的时间序列数据对于了解毛孔在宿主一生中稳定群落动态的程度至关重要。 

综上，我们的研究结果支持了一个模型，即皮肤毛孔在痤疮杆菌生态学中起关键作用。皮肤毛孔提供了一个非常适合痤疮杆菌生长的环境，但种群瓶颈限制了每个毛孔所拥有的遗传多样性的数量。因此，皮肤毛孔通过空间隔离减少了菌株类型之间的竞争，并通过优先效应有利于现有群落。这些力量共同创造了稳定的皮肤菌群。

讨论

1 皮肤毛孔通过中性过程促进种内多样性 

在本研究中，我们已经证明皮肤解剖结构强烈影响痤疮杆菌的种内多样性，痤疮杆菌是人类皮肤上普遍且突出的共生体。我们基于培养的方法和精细的采样方法使我们能够检查痤疮杆菌生物地理学特征，分辨率低至单个SNV和单个皮肤毛孔。该分辨率对于揭示单个皮肤毛孔中的痤疮杆菌种群瓶颈至关重要。由于大多数生长发生在毛孔内，我们认为这种瓶颈有助于不同的痤疮杆菌种群在成年个体身上稳定共存，尽管人群健康状况存在差异并且皮肤暴露于环境中。 在这项研究中，我们没有对足够多的个体进行抽样，来表征不同的护肤方案或痤疮治疗史可能如何改变痤疮杆菌的生物地理学特征。由于我们只研究了没有活动性寻常痤疮的成人受试者，因此需要进一步研究来了解这些发现对痤疮的影响。然而，我们注意到在所有研究对象中发现了相似的模式，这表明我们观察到的毛孔内痤疮杆菌多样性低不太可能是由特定的护肤方案驱动的。 未来的研究将需要了解我们报告的关于痤疮杆菌的发现是否与其他皮肤共生体相关，更广泛地说，隐窝状结构是否会促进其他微生物组中的中性瓶颈和种内多样性。

有趣的是，我们的数据集包括3个毛孔样本，我们从这些样本中培养了多个Cutibacterium granulosum菌落，暗示导致毛孔内痤疮杆菌多样性低的过程也可能适用于人类皮肤上其他相关的毛孔栖息物种。然而，我们并不一定期望这些模式适用于表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和相关物种，它们被认为主要生长在毛孔顶部和皮肤表面。无论如何，表皮葡萄球菌谱系已被证明在个体和广泛的地理区域内共存。虽然这种共存的原因尚不清楚，但一个可能的因素是表皮葡萄球菌中更多的可变基因含量允许更多的生态位特化。 

除皮肤外，小鼠大肠的隐窝已被证明可促进拟杆菌(Bacteroides)的优先效应，而小鼠胃中的隐窝被认为可促进幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)的优先效应。然而，至少对于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)而言，毒素分泌被认为是排除其他菌株不可或缺的一部分；这种非中性过滤机制可以解释为什么尽管存在隐窝和优先效应，但该物种中的菌株共存是罕见的。我们推测隐窝状结构在维持种内多样性方面的重要性将取决于微生物策略，也取决于特定的解剖和生理条件是否会导致单细胞瓶颈。 

2 皮肤毛孔在中性和适应性进化平衡中的作用 

本研究发现，SNV驱动的适应性进化在痤疮杆菌的进化中极为罕见，以至于在这里无法检测到，与关于人类微生物群落中其他稳定成员的快速适应性进化的报道相比，这一发现令人惊讶。虽然低种群规模可以限制适应性进化，但个体身上的痤疮种群可以达到1010个细胞，这表明个体进化的潜力很大。对于我们的观察结果，一个可能的解释是，只有少数有益的突变有待探索。例如，与人类肠道的可变环境相比，皮肤微环境可能相对稳定，来自细菌的选择压力可能受到皮肤上微生物群落相对较低复杂性的限制，或者毛囊结构或皮脂流动可能限制噬菌体的捕食，所有这些都会导致皮肤共生生物的适应机会减少。另一种可能是，我们对大部分中性进化的观察可能源于皮肤上随机力量的支配。

为此，我们假设毛孔的物理结构可能会创造一种环境，在这种环境中，运气和位置(而不是基因组编码的适应性)