毛细胞白血病NGS检出少见BRAF突变

毛细胞白血病（HCL）的诊断基于外周血和/或骨髓中循环异常毛细胞的形态学发现，基于CD11c、CD25、CD103和CD123表达的HCL免疫学评分为3或4，以及B-raf原癌基因（BRAF基因）（7q34）存在BRAF V600E激活突变。124例HCL患者进行了NGS检测（靶向21基因），识别了一组 [ 6/124（2%）] 携带少见BRAF突变的患者：2例患者携带非V600突变（分别为BRAF F595L和BRAF W604L），另外4例患者携带BRAF沉默突变。微滴式数字PCR（ddPCR）显示，在同时携带BRAF V600E和沉默突变的4例患者中，3例为阴性。这些突变在HCL发生发展中的作用仍有待阐明。在ddPCR显示BRAF V600E阴性的情况下，BRAF测序是有必要的。

研究背景

毛细胞白血病（HCL）在1958年得到描述，是一种定义明确的疾病。诊断基于循环异常毛细胞的形态学证据，基于CD11c、CD25、CD103和CD123表达的HCL免疫学评分为3或4，以及B-raf原癌基因存在BRAFV600E激活突变。骨髓活检和免疫组化有助于（鉴别）诊断，尤其是膜联蛋白A1阳性。在实体瘤（恶性黑色素瘤、结直肠癌或非小细胞肺癌）患者中发现的不同BRAF突变主要位于BRAF外显子11或15。报告了三个BRAF突变亚组：BRAF V600突变，包括BRAF V600E/K和除V600E/K以外的V600突变，以及非V600突变。

研究结果

我们报告了BRAF F595L突变的HCL患者。该患者（UPN-50）为一名57岁男性，2011年9月住院，表现为中度脾大，无外周淋巴结受累。血细胞计数显示血小板减少（血小板计数：87×109/L）、单核细胞减少（<0.01×109/L）、中度淋巴细胞增多（6.20×109/L），无贫血（13.4g/dL）和中性粒细胞减少（2.79×109/L）。外周血涂片分析发现33%的典型毛细胞（2.97×109/L），外周血流式细胞术分析（密度梯度离心法分离单核细胞）显示克隆性B细胞增殖（评估为白细胞总数的42%），CD20bright，CD79bbright，具有kappa轻链限制。CD5、CD10和CD38阴性。HCL的四种特异性标记物（CD11c，CD25，CD103和CD123）阳性。未进行骨髓活检，未进行膜联蛋白A1染色。然而，典型毛细胞的骨髓浸润以及外周血和骨髓免疫表型分析足以建立HCL的诊断。未检测到激活错义突变BRAF V600E，但检测到BRAF F595L（c.1783T>C）突变，丰度（VAF）为33%。BRAF合子性拷贝数分析显示没有差异，提示没有杂合性缺失。还检测到两个Krüppel样因子-2（KLF2；19p13）突变。免疫球蛋白重链可变区基因（IGHV）突变（95.7%），具有VH3-7重排。患者接受了克拉屈滨（CDA）单药治疗，但在8.5年后的2020年6月复发，外周血中有5.7%的典型毛细胞。仍然检测到BRAF F595L（VAF = 4.2%）和KLF2突变。进一步测序未发现RAS（KRAS，NRAS）突变。考虑到该突变少见，以及对激酶活性程度的功能结果的怀疑，患者接受CDA单药治疗。达到完全缓解（CR），2023年6月仍处于CR状态且无症状。

第二例患者（UPN-142）在同一等位基因上同时检测到BRAF V600E和BRAF W604L突变。BRAF W604L突变在实体瘤（肺腺癌，恶性黑色素瘤或结直肠癌）中很少有报告，在健康个体（UCSC，gnomAD和ExAc数据库）和HCL中从未报告过。患者39岁，出现胃肠道感染和发热，显示全血细胞减少症，于2021年7月就血液科就诊。患者未出现肝脾肿大或外周淋巴结受累。血细胞计数显示血小板减少（血小板计数：100×109/L），单核细胞减少（0.05×109/L），贫血（11.3g/dL），中性粒细胞减少（1.18×109/L），淋巴细胞计数正常（3.36×109/L）。外周血单核细胞（PBMC）流式细胞术分析显示克隆性B细胞增殖（评估为白细胞的22%），CD20bright，CD79bbright，具有kappa轻链限制。CD5、CD10和CD38阴性。HCL特异性标志物（CD11c，CD25，CD103和CD123）阳性。进行CDA联合利妥昔单抗一线治疗，达到CR，一次随访仍处于CR状态，已持续12个月。

在4例患者中发现BRAF沉默突变，位于598和596位点。有趣的是，所有BRAF同义突变都与BRAF V600E突变位于同一等位基因且两者VAF相似。进行BRAF V600E ddPCR检测，在4例同时携带BRAF V600E和沉默突变的患者中，3例为阴性（表1）。这3例患者携带c.1788T>C（p.G596=）或c.1794T>A（p.A598=）。由于两个突变存在于同一等位基因上，杂交可能被改变了，解释了假阴性结果。与c.1794T>A（p.A598=）不同，c.1794T>C（p.A598=）突变似乎不会损害检测。如果BRAF V600E ddPCR呈阴性，应对BRAF外显子11和15进行广泛测序，以检测其他BRAF突变。

讨 论 

BRAF V600E突变是HCL的分子标志。据报道，高达5%的HCL患者未见BRAF V600E突变。在这些患者中，应排除BRAF非V600E突变的可能性。基于不同突变的激酶活性、RAS依赖性和二聚化谱，将BRAF突变分为三类。I类（如BRAF V600E）具有高激酶活性，氨基酸V600突变，RAS非依赖性，需要BRAF单体。II类（L597P/Q/R/S，K601E等）也是RAS非依赖性，具有高或中等激酶活性，需要BRAF二聚体。III类（A598V等）激酶活性受损，但由于RAS结合和CRAF激活增强，保持MAPK通路信号传导增加。一项研究分析了22个突变，7个被归类为I类，11个被归类为II类，4个被归类为III类。在一项包括1027例实体瘤的研究中，135例患者（7.6%）存在BRAF突变，其中101/135激酶激活，15%激酶受损（20/135），10%激酶未知（14/135）。正如预期的那样，常见的突变是BRAF V600E，发生率为64%（86/135），但未报告有患者存在BRAF F595L。常见的激酶受损III类突变涉及密码子594，在11%的患者（15/135）中观察到，特别是D594E/G/H或D594N突变。与BRAF V600E突变相反，这些突变可能与RAS激活突变有关。使用适当的方法检测所有这些突变至关重要。一些BRAF突变可能对BRAF抑制剂不敏感，另一些可能对MEK抑制剂敏感。

先前仅报道了3例伴有非V600突变的HCL患者：2例外显子11（F468C，D449E）突变患者和1例同时携带BRAF V600E和BRAF S602T突变的患者。有组织细胞肉瘤患者报告了BRAF F595L突变，该突变破坏对催化至关重要的BRAF激酶结构域D594F595G596基序。作者表明，该突变与中等激酶活性有关，与HRAS Q61共存促进致癌信号。BRAF外显子15 F595L突变的HCL患者对CDA单一疗法有反应。另外注意，该患者不存在任何相关的不良预后因素。IGHV谱发生突变（95.7%），使用VH3-7重排。在HCL中，未突变（UM）IGHV谱和使用VH4-34通常与CDA耐药性以及较短的无进展生存期和总生存期有关。我们报告的第二例HCL患者同时携带BRAF V600E和W604L突变。该患者接受CDA加利妥昔单抗治疗，达到CR。

同义突变在HCL中的作用仍有待研究。在一项对主要来自实体瘤样本（包括黑色素瘤）的659194个同义（沉默）突变的研究中，沉默突变是仅次于错义突变（64.1%）的第二常见的点突变类型（23.4%）。同义突变不会改变氨基酸序列，大多数在功能上是中性的。同义突变的临床意义仍有待确定，但其可以通过改变剪接调控位点、mRNA 稳定性、miRNA结合位点或翻译效率来改变蛋白质水平或蛋白质构象。无论是在编码区内还是在编码区外，都可能影响基因表达，并可能有助于肿瘤发生和癌细胞适应性。值得注意的是，在我们的队列中，所有同义突变都与BRAF V600E突变共存。使用ddPCR时，由于杂交受损和检测的特异性（无法检测BRAF非V600突变），其他BRAF突变可能会被误检。这些突变在HCL发生发展中的作用仍有待阐明。