抗HCV中和抗体的研究进展

【关键词】  丙型肝炎病毒;,中和抗体;,假病毒

　　[关键词]丙型肝炎病毒; 中和抗体; 假病毒

　　丙型肝炎病毒（HCV）为具包膜的单股正链RNA病毒,属于黄病毒家族。HCV是已知惟一能造成慢性感染的RNA病毒（除逆转录病毒外）, 据估计, 目前全球约1.7亿HCV感染者中, 60%~80%为慢性携带者, 而持续性感染终发展为肝硬化/肝癌的机率高达3.5%～20%[1]。如此高比例的慢性感染率意味着在可能的病毒免疫逃逸机制下, 机体往往无法激发或维持有效的抗病毒免疫反应。而对于急性感染中一小部分能形成自限性感染的机体免疫保护机制现在还不十分清楚,但有越来越多的证据表明, 细胞免疫在其中发挥主要作用, 即在感染早期建立针对多个HCV抗原表位、 多特异性的CD8+ CTL和CD4+ Th强细胞免疫屏障, 对于急性感染的控制与病毒清除至关重要[2]。然而, 作为获得性免疫的道防线, 体液免疫尤其是中和抗体在阻断HCV感染和免疫清除中的作用, 长久以来一直困于没有简易有效的检测与评价手段而所知甚少, 有限的实验结果之间也往往彼此相左。近两年, 随着HCV细胞培养模型和以慢病毒载体为基础的HCV假病毒模型的建立与成功运用, 这一领域成为新的研究热点。

　　1  HCV包膜糖蛋白的结构与功能

　　HCV基因组长约9.6 kb, 编码一个长约3000个氨基酸残基的多聚蛋白前体, 在宿主信号肽酶和病毒自身编码蛋白酶的作用下生成4种结构蛋白（C、 E1、 E2、 p7）和6种非结构蛋白（NS2NS5B）, 其中E1、 E2为包膜糖蛋白, 是中和抗体的主要靶抗原。E1和E2都属于I型整合膜蛋白, 包括一个较大的N端膜外区和一个C端疏水性跨膜结构域。在其各自N端上游信号肽的引导下, 定位于内质网膜上完成高度的N糖基化, 并被宿主信号肽酶切割后, 非共价结合形成成熟的异源二聚体滞留于内质网上, 在病毒萌出时与膜结构一同包裹在病毒表面。E1/E2的这种天然构象与修饰对于HCV的感染性是非常重要的[3]。 E区是整个HCV基因组中变异大的部分, 尤其是位于E2蛋白N端的约27个残基, 即HVR1（hypervariable region 1）。迄今为止, 每一次分离得到的HCV病毒, 该高变区序列均不相同。多数研究表明, HCV HVR1是中和抗体的重要靶位点, 内含数个线形表位和一个部分构象限制性表位。但是抗原性区域的高变性也使得在宿主免疫压力的选择下, 新出现的突变株可以不断逃逸针对此前优势株HVR1抗体的中和作用, 成为导致HCV慢性感染中免疫逃逸的重要原因之一[4]。同时, 近有研究显示, HVR1还可能通过模拟免疫球蛋白IgG可变区的结构, 伪装成宿主自身抗原, 从而达到逃避体液免疫识别的目的[5]。有趣的是, 缺失HVR1的重组HCV病毒同样具有感染性并且仍然可以在黑猩猩模型上造成持续性感染, 但是其毒力明显减弱且子代病毒在继发传染中再不能建立慢性感染[6]。这些结果也表明, HVR1在HCV包膜蛋白介导的病毒侵入过程中发挥了重要作用, 但并非是必须的, 提示我们在E1/E2蛋白上还存在其他的中和表位, 尤其是与宿主细胞受体结合的部位, 由于其具有重要的生物学功能, 因此必然具有一定的保守性, 对这些保守性中和表位的研究意义重大。目前对HCV受体及其与HCV包膜蛋白的相互作用仍所知有限。已知可能的受体分子包括四跨膜蛋白家族成员CD81, B族I型清道夫受体（SRBI）, 低密度脂蛋白受体（LDLR）以及甘露糖结合凝集素LSIGN和DCSIGN, 而E2则是与他们直接相互作用的亚单位。其中, 体外和体内实验业已证实CD81和SRBI在HCV侵入过程中发挥着直接作用, E2蛋白上和他们相互作用的位点信息也被逐渐确认, 针对这些位点的单克隆抗体（mAb）往往具有中和活性[7]。然而, 在非肝源性细胞系中共表达CD81和SRBI并不能导致细胞对HCV的易感性, 说明在肝细胞表面很可能还存在着为HCV侵入所必须的其他受体分子。对HCV受体和病毒侵入机制的进一步研究对于HCV疫苗和特异性药物的研制具有重要意义。

　　2  中和抗体检测与评估的方法 

　　一般而言, 中和抗体是指在细胞培养或动物模型中具有抑制病毒感染能力的保护性抗体; 通过自然感染或人工免疫途径所建立的中和抗体反应是抗病毒免疫保护的重要组成部分。然而, 由于黑猩猩是迄今为止惟一可靠的HCV易感动物模型, 而稳定的HCV细胞培养系统直至近才基本建立, 缺乏简易有效的检测与评价手段长久以来一直是阻碍HCV中和抗体定性与定量研究的主要原因。基于黑猩猩动物模型的体内中和实验与基于T淋巴细胞半复制子模型的体外中和实验[8], 在将近10年的早期研究中一直作为仅有的直接检测手段, 为认识HCV中和抗体反应打下了重要的基础, 但是材料的局限性和操作的复杂性妨碍了他们的广泛应用。人们一直致力于发展更为简易可靠的体外中和实验方法, 并获得了一定的进展。早发展起来的方法包括检测抗体对膜蛋白E2与靶细胞（如MOLT4细胞系）结合的抑制作用, 即结合中和（neutralization of binding, NOB）实验[9], 或者检测抗体在HCV对单核细胞的感染或与成纤维细胞的结合过程中的抑制作用[10]。这些方法往往只是间接反映中和作用的强度, 很难准确定量。由杆状病毒载体在昆虫细胞内表达的HCV病毒样颗粒（VLP）可以模拟HCV病毒粒子的天然结构[11]; 构建能表达去除了C端跨膜区的E1/E2蛋白的假型水疱性口炎病毒（VSV）或假型流感病毒,将修饰后的E1/E2表达到相应病毒的包膜表面, 可以与相应的受体结合从而具有与HCV相似的细胞嗜性[12]。但是无论是VLP还是假型VSV/HCV病毒, 其感染性都非常低甚至没有感染性, 因此实验结果不稳定有时彼此矛盾, 阻碍了他们在研究HCV细胞侵入过程以及定量中和中的应用。根据Naldini等[13]于1996年发展的3种质粒（包装质粒、 转导质粒、 包膜质粒）共转染293T细胞产生慢病毒载体（lentiviral vector）的技术, 2003年, Cosset FL实验室利用逆转录病毒载体的两个重要特性（可插入外源糖蛋白; 复制缺陷的病毒颗粒可整合并表达标记基因）, 构建携带完整的HCV E1与E2包膜糖蛋白的表达质粒, 制备感染性的HCV假型包膜病毒颗粒。该假型病毒模型的包膜蛋白源于完整的HCV包膜糖蛋白, 且该病毒可感染肝源性的传代细胞（如Huh7）或原代肝细胞。一旦病毒感染细胞后, 转基因质粒中标记基因（如EGFP、 LUC或βGAL等）的表达可直接便捷地观察到, 因此可将其发展为一种筛选HCV受体结合分子的方法, 同时亦可发展为一种体外中和抗体的检测手段, 对HCV感染的体液免疫应答及中和抗体的产生进行研究。一系列的研究结果表明: ①HCV假型颗粒呈现出嗜肝性且可被抗E2的mAb或HCV患者血清中和, 可用作研究HCV感染早期特性（如宿主嗜性、 受体结合、 膜融合及血清中和等）的有效模型; ②在慢性HCV患者中可检测到中和抗体的存在, 除了在HCV的HVR1高变区存在一个中和位点外, 其他区域亦可能存在中和表位, 且该类中和抗体有广谱反应性; ③该体外中和实验方法所获得的结果与早先建立了体内中和（黑猩猩模型）或体外中和（淋巴细胞系）实验结果一致, 基于假型包膜病毒感染模型的体外中和试验敏感、 特异、 重复性好、 可定量、 易于操作[14]。近来, 随着完整的HCV全细胞培养模型的基本建立, 使得体外稳定高效的获得感染性病毒颗粒并用于中和抗体的检测与评价成为可能。但是, 由于操作此类HCV感染性活病毒必须在BSL3级以上实验室条件下, 在一定程度上限制了这种方法的运用。因此, 利用上述相对安全的HCV假病毒模型是目前为经济有效的手段。事实上, 假病毒技术正发展成为一种研究高危病毒（如SARS病毒、 埃博拉病毒和禽流感病毒等）的有效手段。

　　3  中和抗体在HCV抗感染免疫中的作用

　　众所周知, 体液免疫尤其是以中和抗体为主的保护性抗体, 在阻断病毒感染、 抑制病毒复制的过程中发挥着关键作用, 从而为细胞免疫终清除病毒及感染细胞创造了条件。但是, 人们对于中和抗体在抗HCV感染免疫中的作用却知之甚少且充满争议。早期的临床研究显示, 自然感染过程中机体所激发的免疫力不足以产生对HCV的完全保护, 大部分急性感染者发展为慢性携带。而初始感染自愈的病人即使体内存在较高水平的抗包膜蛋白特异性抗体, 对继发感染也没有完全的保护作用; 另一方面, 部分自限性感染者的急性恢复与病毒清除可以在未生成抗HCV抗体及不发生血清转化的情况下由细胞免疫完成[15]。黑猩猩动物模型中也重复了同样的结果[16]。这些研究提示, 体液免疫在HCV自然感染过程中可能不起主要保护作用。进一步的免疫攻击实验表明, 用哺乳动物细胞表达的重组HCV包膜蛋白免疫可以保护黑猩猩抵抗低剂量的同株病毒攻击, 但是对于异株病毒攻击却没有明显的保护作用[17]。使用HVR1合成肽免疫黑猩猩也获得了类似的结果[18]。同时, 由于HVR1抗血清可以在黑猩猩模型和细胞模型上中和同源病毒的感染性, 因此HVR1被视为中和抗体的主要靶点, 有研究表明, 能否在感染早期诱导抗HVR1抗体可能与急性感染的恢复相关[19]。但是, 由于HVR1处于宿主免疫压力之下, 通过不断变异来逃逸机体内此前优势株抗体的中和作用, 这是HCV免疫逃逸引起慢性感染的重要机制。临床实验证实, 患者体内HVR1序列的变化可以预测感染及治疗后的转归。序列变异程度越大、 准种复杂程度越高则干扰素疗效越差,发展为慢性感染的几率越高[20]。这些结果提示, 针对HVR1的中和抗体在HCV感染过程中的保护作用非常有限。近年来, 随着研究的深入, 人们对HCV免疫保护的范畴有了新的认识。因为HCV急性感染多数表现为无症状无病理损伤状态, 仅伴随着血清中病毒RNA和转氨酶的一过性升高, 而持续性感染才是导致丙型肝炎各种慢性病理反应的元凶, 因此采用预防慢性感染作为免疫保护的重要指标而非早期所采用的预防急性感染的能力（即消除性免疫力）似乎更为合理。从这个层面上, 人们发现在先前的临床实验与黑猩猩模型中, 尽管初始感染并不能防止继发感染, 但是大多数仅仅表现为短暂的远低于初次感染时的病毒血症并随即从急性感染中恢复; 而免疫攻击实验则表明, 虽然重组HCV包膜蛋白免疫后并不能获得对HCV的完全保护, 大多数黑猩猩却能很快地清除病毒, 不会发展为慢性感染, 无论使用同源还是异源的病毒株攻击。同时, 这种保护作用与能阻断E2蛋白与其受体CD81或易感细胞结合的抗体滴度相关, 而与HVR1抗体无关[21]。这些结果使得研究者开始重新评价中和抗体在抗感染免疫中的作用及其与体液免疫保护之间的关系。由于HCV假病毒模型的出现解决了长久以来缺乏简易可靠的体外中和试验的阻碍, 人们在这一领域进行了大量的研究。首先, 证实了除HVR1之外, 其下游还存在数个中和表位, 该类中和表位可能位于同宿主细胞受体结合的区域或是对包膜蛋白结构与功能至关重要的部位, 具有一定的保守性; 所诱导的中和抗体在体外实验中能中和多株不同亚型的假型HCV病毒, 具有广谱交叉中和活性。其次, HCV感染者尤其是慢性感染者体内可检测到广谱交叉反应中和抗体, 来自慢性感染者的血清或用其制备的免疫球蛋白通过被动免疫可以预防HCV感染; 对于临床用血制品的实验室检测与流行病学调查也支持这一结果[22]。为了进一步分析中和抗体在控制HCV病毒复制与免疫清除中的作用, 通过比较从急性感染中恢复的自愈患者和终发展为持续性感染的慢性患者体内中和抗体的产生及变化差异, 研究者发现, 广谱交叉反应中和抗体的产生是一个缓慢的过程, 很难在感染早期或急性恢复期诱导, 往往要在病毒复制相对稳定的慢性感染期才能检测到; 而此时病毒已经成功逃逸了宿主细胞免疫的清除, 之后所产生的中和抗体更可能是机体对T细胞免疫不足的代偿性反应[23], 它们的存在对控制慢性感染者体内病毒的复制、 减缓疾病的进程以及降低病毒的传染力可能起到了一定的作用。这些结果也提示我们, HCV在急性感染过程中可能通过某种机制延缓中和抗体的产生直至终建立慢性感染。近有研究显示, 少数急性感染者体内也存在中和抗体, 且在感染进程中的中和能力的增强伴随着病人体内病毒载量的降低, 并在很大程度上预示了患者终的转归[24]。综上, 尽管中和抗体在HCV感染清除中可能并不起到主要作用, 但是通过主动或被动免疫途径建立广谱交叉中和抗体反应将是HCV免疫预防策略的重要途径, 并为HCV疫苗的研制提供了思路。

　　4  广谱交叉中和表位的研究与设计

　　HCV基因组存在2种不同层次的变异性。目前已知的HCV序列包括至少6种基因型和70多种基因亚型; 而在同一个体中还同时存在多种序列且有同源性的HCV相似株, 即准种（quasispecies）。在感染的不同阶段, 准种在机体的免疫压力选择下也发生变异。HCV的这种高度变异性及异源性是目前HCV疫苗研制所面临的大障碍。而诱导广谱交叉保护中和性抗体和细胞免疫应答已成为HCV疫苗研究的基本方向[25]。由于HVR1是中和抗体的重要靶位点, 因此一直以来是疫苗研究的重要靶抗原。然而HVR1的高变性使得针对单一序列HVR1抗体难以产生有效的免疫保护。但有证据表明, HVR1内部尤其是位于C端的某些关键残基仍具有一定的保守性, 使得HVR1能够保持相对稳定的空间构象和理化性质。研究发现, 具有相似保守性特征的HVR1之间还存在明显的交叉抗原性, 而HCV感染者体内抗HVR1抗体以及针对HVR1的mAb也都表现出不同程度的交叉反应性, 可以与其他毒株的HVR1结合。利用噬菌体展示肽库技术筛选得到了多种能模拟不同毒株HVR1抗原性的模拟表位（mimotope）, 免疫动物获得的抗体具有广泛的交叉反应活性, 这给中和抗体的研究带来了新的提示。然而, 在黑猩猩试验中显示, 这类交叉反应抗体似乎并不具有交叉中和活性[26], 因此其可行性还需要进一步的研究验证。现已证实, 除HVR1之外HCV包膜蛋白上还存在多个中和表位。这些表位大多位于受体结合区等比较保守的部位, 针对这些表位的mAb在体外实验中具有广谱交叉中和活性。然而, 此类表位多数为构象依赖性, 由于其天然结构不易模拟以及可变区免疫优势（immunodominance）的存在, 如何经免疫途径产生相应的抗体仍是当前疫苗研制中所面临的重要难题[27], 或许表达去除HVR1的HCV病毒样颗粒将是可能的方向之一。近来有研究发现, 在HVR1下游附近（412-423）包含一个在已知6种HCV基因型中均高度保守的线性中和表位, 其mAb AP33能在体外中和所有6种基因型的HCV假病毒[28]。这一线性广谱交叉中和表位为HCV预防及治疗性疫苗的研制带来了新的希望;类似的表位仍有待发现, 并将极大地推动HCV保护性免疫机制的研究。

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　　基金项目: 国家自然科学基金资助项目（30571673）

　　(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京 100052)

作者：张柯, 阮力, 谭文杰