5/6肾切除大鼠早期模型中p38MAPK的动态变化

【摘要】  目的:研究5/6肾切除大鼠模型中p38MAPK磷酸化的动态表达情况。方法:82只雄性SD大鼠分为两组：5/6肾切除模型组72只，假手术对照组10只。模型组造模完成后，分别于肾切除早期（术后1/2 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、4 d）相应时间点处死，每组9只，假手术组于术后12 h处死，称量各组体重及残余肾重，计算肥大指数；下腔静脉取血留取血清测定血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）；以Western blotting免疫印迹法检测肾皮质磷酸化p38MAPK活性的表达情况；以病理光镜和电镜观察肾小球、肾小管及肾间质组织形态学及超微结构的变化。结果:模型组与对照组相比，肾脏呈代偿性肥大，肥大指数增高（P<0.05），Scr和BUN升高（P均<0.01）。免疫印迹法显示5/6肾切除术后1/2 h、1 h、3 h、6 h、12 h磷酸化p38信号呈递增趋势，尤以12 h信号强，之后信号减弱，2 d时几乎不可见，4 d有较弱的信号，假手术组未见明显信号。光镜下，发现肾小球有轻度系膜细胞增生，基质增宽不明显，肾小管偶有轻度变性，间质偶有炎性细胞浸润。电镜下，偶见足突局灶融合。结论:5/6肾切除大鼠在造模完成后12 h时磷酸化p38MAPK表达强。

【关键词】  5/6肾切除 p38MAPK 信号转导 磷酸化

    The dynamic ex[x]pression of p38MAPK in the 5/6 nephrectomized rat model  CHEN Xin-xin，SU Zhen，YA Gang，HUANG Chao-xing．Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou,325000

    Abstract:  ob[x]jective:To investigate the dynamic ex[x]pression of phosphorylating-p38 in the 5/6 subtotal nephrectomized (STNx) rat model. Methods:Eighty-two male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups: STNx group(n=72) and sham group(n=10).Rats in STNx group were sacrificed in early nephrectomy at half of an hour, 1 hour, 3 hour, 6 hour, 12 hour, 1 day, 2 day and 4 day, 9 rats for each; rats of sham group were sacrificed at 12 hour. The body weight, kidney weight were measured and the kidney/body weight ratio was calculated in different groups. Serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN) were determined. The ex[x]pressions of phosphorylating-p38 were measured with Western blotting in renal cortex. The histomorphology and ultrastructure of the renal glomerulus, tubule and interstitium were observed under light microscope and electron microscope. Results:The kidney were augmented for compensation in SNTx group and the kidney/body weight ratio in SNTx group was higher than that of the sham group, the same as the Scr and BUN(P<0.01).Western blotting displayed the signal of phosphorylating-p38 was increasing gradually from half of an hour to 12 hour after nephrectomy, especially the highest at 12 hour, then the signal weakened, signal almost disappear 2 days later and recorvered to tenuity signal 4 days later. Almost no ex[x]pression of phosphorylating-p38 was shown in the sham group. It was displayed under the light microscope there were little proliferation of mesangial cells in renal glomerulus, there was little degeneration in the renal tubule, and little inflammatory cellular infiltration in the renal interstitium. That podocytes were partly fused under electron microscope. Conclusion:The highest ex[x]pression of phosphorylating-p38 is at 12 hour in 5/6 nephrectomized rat model.

    Key words:  5/6 nephrectomy; p38MAPK; signal transduction; phosphorylation

    慢性肾功能不全（chronic renal insufficiency，CRI）发展到一定程度将不可逆转，终将进展到慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）。从CRI的代偿期到失代偿期，是防止其转入CRF的关键阶段，这一阶段发生的任何可导致急性肾损伤的因素都有可能促使肾功能急剧恶化，因此，如何延缓CRI进展，已成为医学界面临的重大课题。目前有关CRF早期的信号转导途径国内外尚未见报道，了解其早期信号转导通路的变化，对揭示CRF发生、发展的分子机制有重要意义。p38MAPK是近年来细胞生物学研究的热点之一，是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族的一个亚类，其信号通路是生物信号引起核反应的重要通路，在细胞生长、死亡、细胞周期、炎症及应激反应的调控中起重要作用[1]；p38MAPK还参与了多种肾脏病发病过程,是肾脏固有细胞重要的信号转导分子。本研究通过5/6肾切除术建立CRF的大鼠模型，观察了造模后早期大鼠体内的p38MAPK信号转导通路的变化，探讨CRF早期的发病机制，为寻找预防或延缓肾功能衰竭的方法提供理论依据。

    1  材料和方法

    1.1  试剂与药物  兔抗大鼠磷酸化p38MAPK（phospho-p38MAPK）和兔抗大鼠p38MAPK（购自cell-signal公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（购自Santa-Cruz公司）；BCA蛋白定量试剂盒和ECL化学发光底物（购自picece公司）；PVDF膜（购自millipore公司）。

    1.2  动物模型的制备和分组

    1.2.1  实验动物及分组：由温州医学院实验动物中心提供，SD大鼠，雄性，清洁级，5周龄，体重150～170 g，适应性喂养1周。大鼠分为两组：5/6肾切除模型组72只和假手术对照组10只。

    1.2.2  5/6肾切除模型的制备：3%戊巴比妥纳(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉大鼠，将大鼠俯卧位四肢固定于鼠板上，以脊胁角为标志局部剪毛，常规消毒。无菌操作下，在大鼠左背部中1/3脊柱旁开1.5 cm行纵切口2 cm，暴露左侧肾脏，剥离肾包膜, 将脂肪组织及肾脏一起拉至切口外，用无损伤血管钳钳夹肾蒂，切除约占左肾2/3的上、下极，切口呈“⌒”形，止血海绵压迫止血，去除肾蒂夹，还纳残余的1/3肾脏，逐层缝合。1周后行右肾切除术，麻醉同上，切开右背部，暴露右肾，结扎肾蒂，切除右肾。假手术组切口位置、大小同5/6肾切除术，两次暴露肾脏，不切除肾脏，轻翻肠袢，游离肾包膜后关闭腹腔。

    1.3  标本收集  所有动物均采用标准颗粒饲料喂养，自由进食、饮水。模型组于术后1/2 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、4 d处死大鼠，每组9只。假手术对照组于术后12 h处死，共10只。各组均行下腔静脉取血后处死，留取血清，切取残留的1/6肾脏，去掉被膜，滤纸吸干血迹后称重，部分肾组织于-80 ℃保存，行Western blotting免疫印迹法检测，部分肾组织用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定，分别行光镜和电镜检查。

    1.4  检测指标和方法

    1.4.1  一般情况：各组动物体重、残余肾重、肥大指数（肾重/体重）变化。

    1.4.2  血尿生化指标检测：全自动生化分析仪检测Scr(酶法)、BUN的动态变化。

    1.4.3  以Western blotting免疫印迹法检测肾组织磷酸化p38：①取-80 ℃保存的肾皮质组织100 mg，4 ℃ PBS润洗，加预冷的1 ml细胞裂解液〔20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L NaEDTA，1% Triton-100，2.5 mmol/L焦磷酸钠，1 mmol/Lβ-磷酸甘油，1 mmol/L Na3VO4，1μg/ml亮肽素，100 mmol/L PMSF〕，匀浆，充分裂解组织细胞，冰上放置30 min，超声粉碎仪裂解细胞（超声5 s，间歇5 s，共10 min，功率为400 W），超速离心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，收集上清。②BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度：用蛋白标准品作出标准曲线，紫外分光光度计测定样品吸光度，根据标准曲线得出样品的蛋白浓度，调节蛋白浓度，上样量为40μg。③蛋白质电泳和印迹电转移：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳配置质量分数为10%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳条件：恒压，先80 V，待溴酚蓝到达分离胶后改电压为130 V，直至溴酚蓝跑到凝胶底部；电泳结束后进行印迹转移，应用聚乙烯二氟（PVDF膜）380 mA恒流电转40 min，转移完毕后分别用立春红和考马斯亮兰染膜和胶。④Western印迹分析：采用质量分数为5% BSA的TBS-T封闭液室温封闭1 h，TBS-T洗膜3次后，加入单克隆兔抗大鼠磷酸化p38或单克隆兔抗大鼠总p38(总p38为磷酸化p38起校正内参的作用，浓度均为1:1000稀释），于4 ℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1:2000稀释），室温置1 h；TBS-T洗膜3次，化学发光底物ECL显色、胶片曝光，用UVP凝胶成像扫描系统对胶片条带进行定量性密度测定，Quantity One软件计算其灰度值。

    1.4.4  肾脏组织石蜡切片的制作及HE和PAS染色：以4%的多聚甲醛固定肾组织，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成石蜡块。切成3μm厚的石蜡切片，予常规脱蜡至水，HE染色步骤如下：苏木素染色6 min，0.5%的盐酸-酒精分化，伊红复染5 min；PAS染色:1%高碘酸液浸泡17 min，蒸馏水冲洗，PAS液避光染色30 min，组织染成紫红色，苏木素复染6 min，0.5%的盐酸-酒精分化；脱水、透明、封片，显微镜下观察。

    1.4.5  电镜：取肾皮质组织切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定1h，逐级丙酮脱水，EPON812树脂包埋，半薄切片光镜下定位肾小球后，用LKB超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察肾脏超微结构、拍片。

    1.5  统计学处理方法  采用SPSS12.0 统计学软件，经方差齐性检验后再进行显著性分析，对有差异者选择dunnett检验进行两两比较。

    2  结果

    2.1  各组大鼠肥大指数（残余肾重/体重）及肌酐、尿素氮的比较  5/6肾切除术后残肾体积增大，手术切口疤痕处内陷，其余部分外凸，形状不规则。模型组与假手术组相比，肾脏肥大指数增加（P均<0.01），Scr和BUN明显升高（P均<0.01），见表1。

    2.2  Western blotting检测肾皮质p38表达  5/6肾切除造模完成后，发现术后1/2 h、1 h、3 h、6 h、12 h磷酸化p38信号呈递增趋势，尤以12 h信号强[灰度值为（0.829±0.017），约是1/2 h时的1.63倍]，然后信号减弱，2 d时几乎不可见，4 d恢复为较弱信号(见表2和图1)。假手术组未见明显信号。

    2.3  光镜组织形态学观察  假手术组肾小球未见明显异常，系膜细胞无增生，毛细血管襻开放，血管壁正常，间质无明显炎性细胞浸润。5/6肾切除组残肾肾小球体积增大不明显，基底膜未见明显增厚，有轻度的系膜细胞增生，基质增宽不明显，偶见球囊黏连和间质炎性细胞浸润，肾小管正常或轻度变性（见图3和图4）。

    2.4  电镜超微结构观察  假手术组肾小球基底膜均匀，无明显增厚，上皮细胞足突均匀分布，无融合。5/6肾切除组，偶见足突局灶融合，上皮细胞细胞核固缩，核膜间隙扩大，染色质皱缩，颜色变深，局灶性细胞间质水肿，内质网扩张，线粒体弯曲，排列不齐；近曲小管细胞膜内褶扩张，基质中黑色颗粒状有形成分沉积(见图5)。

    3  讨论

    5/6肾切除模型由Chanutin等于1932年首先报道，依据Brenner提出的“三高学说（高灌注，高滤过，高压力）”原理而建立的一种慢性肾衰动物模型[2]，是的肾小球硬化模型，该模型减少了肾单位数量，通过增加肾血流量和肾小球滤过率引起肾内压增高、蛋白尿和高血压，导致残肾组织肾小球进行性硬化，系膜区基质增生等改变，终出现肾组织纤维化及肾功能衰竭。其肾小球变性坏死过程与人慢性肾衰的病理生理过程相似，肾小球损伤与人的局灶节段性肾小球透明变性和硬化相似[3]。我们依照经典的手术方法复制了5/6肾切除术[4]，通过对模型大鼠的观察以及相关指标的检测发现，造模后早期（4 d内）即出现残余肾的肥大指数增加，血肌酐和尿素氮升高，由于时间短，肾脏病理改变轻微，未出现明显的肾小球代偿性肥大及硬化，难以达到慢性肾衰竭的诊断标准，此期可视为大部分肾切除所致的急性肾功能不全期，与文献[5]所表述一致，我们估计其为5/6肾切除制造CRF模型的早期阶段。因为该模型制作方法已相对成熟，所以不失为反映慢性肾衰早期阶段的一个好方法。

    MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是联系细胞膜受体与细胞内重要调节靶目标的进化保守的酶类，在细胞信号转导方面起重要作用，它能将细胞外刺激信号转到细胞及其核内，引起细胞一系列生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)。p38MAPK信号通路作为MAPK家族的主要成员，通过对细胞内信号的传递参与细胞对外界许多刺激的调节反应。p38MAPK还能与细胞内其他信号通路之间相互作用，是细胞内信号传递系统的交汇点或共同通路，通过非磷酸化转化为磷酸化状态来促进下游底物的磷酸化，快速实现信号传递[6]。激活的p38MAPK由细胞浆移位至细胞核，导致细胞生长、增殖、分化、凋亡。有研究表明，p38MAPK与多种肾脏疾病的发生、发展有关。在缺血/再灌注损伤中，p38MAPK的活化可导致细胞凋亡和组织损伤[7]。Chen H等[8]发现在糖尿病后期发展阶段中，通过p38MAPK信号转导系统导致了肾脏和心血管功能不全。Gruden等[9]证实, 机械性伸缩刺激可诱导人系膜细胞通过PKC 依赖机制激活p38MAPK。以上研究表明,p38MAPK参与了多种肾脏病发病过程,是肾脏固有细胞重要的信号转导分子。

    细胞外的物理应激因子，如高渗透压、热休克、紫外线、电离辐射、切应力以及细胞因子、内毒素脂多糖(LPS)等都能触发p38信号途径[10]，诱导细胞内蛋白质合成与分泌、细胞分化及凋亡等生物效应。Sato H等[11]发现在出血性休克中，肾脏p38MAPK被激活，促进肾脏致炎因子的表达，继而发展成肾功能不全，其认为p38MAPK在导致肾脏损伤中是必需的，而p38MAPK的阻断剂的激活阻止了肾功能不全的发展。李荣山等[12]研究发现在肾缺血再灌注2 h时p38MAPK表达强，以后逐渐下降；且肾功能损害随再灌注时间延长而逐渐加重,肾缺血/再灌注时，肾缺血可引起基本量的p38MAPK激活，而再灌注可引起更大量的p38MAPK活化，且随着p38MAPK表达量的增高,细胞凋亡、组织损伤和相应的肾功能损伤程度加重[13]。因此，我们认为5/6肾切除术是一种人为的致肾脏损伤因素，应该存在p38MAPK的激活和表达。

    预实验时我们发现，磷酸化p38在5/6肾切除术后1/2 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、1周、2周这些时间点中，以造模后12 h升高显著，因此我们选择假手术组术后12 h作为对照。

    本研究显示：5/6肾切除术后1/2 h、1 h、3 h、6 h、12 h，磷酸化p38表达呈进行性升高，以术后12 h升高显著，术后2 d时信号减弱不可见，4 d时又出现微弱信号；假手术组磷酸化p38信号几乎不可见。提示5/6肾切除术作为一个物理应激因子，触发了p38信号转导通路，诱导细胞内磷酸化p38表达增加，且表达量呈现动态演变过程，进一步启动下游的各种因子而诱导细胞内蛋白的合成。

 

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作者：陈薪薪

作者单位：温州医学院附属医院 肾内科，浙江 温州 325000