糖尿病肾病诊断生物标志物研究新进展

【摘要】糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病主要的微血管并发症。长期以来，DN早期诊断临床上主要依赖微量白蛋白尿(microalbuminuria, Malb)的测定，但作为DN诊断生物标志物(biomarker)其特异性和对疾病严重程度的预测价值受到质疑。所以人们不断寻求DN诊断的新标志物，包括尿IgG和IgM、nephrin mRNA、Smad1及尿液炎症标志物。尽管目前已经发现许多具有潜在价值的DN诊断生物标志物，但其对DN进展的预测价值尚未经过循证医学实验验证。
【关键词】 糖尿病肾病; 生物标志物; 蛋白质组学
糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病主要的微血管并发症，以持续蛋白尿、肾功能进行性下降和高心血管疾病发病率及死亡率为特征[1]。据估计，2030年全世界糖尿病患者数量将从2000年的1.71亿增加到3.66亿，其中30%～40%的2型糖尿病将发展为DN，20%～40%的1型糖尿病15～30年后也将发展为DN[2]，DN已成为引起终末期肾衰常见的原因之一。如何早期发现DN，并进行早期干预是临床上迫切需要解决的问题。尽管肾活检是早期明确诊断DN的金标准,但作为一项创伤性和技术复杂的检查，它难以普及和临床反复进行。因此积极寻找DN早期诊断生物标志物(biomarker)将具有非常重要的临床意义，为此国内外近年来进行了大量的实验和临床研究，作者简要综述有关进展。
1 DN诊断中的生物标志物
1.1 微量白蛋白尿(microalbuminuria, Malb)

长期以来，DN早期诊断临床上主要依赖Malb测定。正常情况下，肾小球滤过膜存在电荷选择性屏障，在静电同性排斥作用下，绝大多数的白蛋白不能通过滤过膜。而在DN早期，由于肾小球滤过膜带负电荷的乙酰硫酸肝素、唾液酸等成分减少，使肾小球滤过膜的电荷选择性降低，并干扰了蛋白多糖与细胞外基质间亲和力。此外，近研究表明高糖环境可致肾小球内皮细胞外被的多糖蛋白复合物受到破坏，致使肾小球滤过膜上滤孔孔径增大以及肾小球滤过膜富含带负电荷的结构成分改变[3-4];细胞因子和生长因子通过多途径改变血流动力学应力导致DN结构改变，足细胞增宽伴随每个肾小球足细胞数量减少，从而导致白蛋白在尿中排出增多。Sampaio等[5]应用免疫比浊法对293例糖尿病患者进行横断面研究表明，当尿白蛋白浓度(UAC)界定值为22 mg·L-1时，敏感性为82.5%，特异性为74%，当尿白蛋白/尿肌酐(UACR)界定值为27.3 mg·g-1时，敏感性为83.3%，特异性为80.9%。而UAC低界定值(10 mg·L-1)虽然其敏感性提高(94.2%)，但特异性显著降低(48.6%)，UACR也是如此。研究表明，UAC和UACR在反映Malb水平的变化中其精确性相似，对1型和2型DN诊断的敏感性也无差异。
大多数研究认为，Malb程度与DN的预后密切相关。日本学者通过对5 449例糖尿病患者进行5年随访，监测其尿白蛋白与肌酐的比值(ACR)，发现ACR升高即使只在正常高限，也可预测肾小球滤过率估测值(eGFR)的下降[6]。但是，近研究发现，只有30%～45%的Malb患者在10年内会进展为蛋白尿[7]，而且，临床许多情况下(如运动、发热、原发性肾脏病、感染等)Malb也可以显著升高。因此，Malb作为DN诊断生物标志物其特异性和对疾病严重程度的预测价值受到质疑。
1.2 免疫球蛋白(IgG和IgM)

IgG是血液中主要免疫球蛋白，多数以单体形式存在，主要由脾和淋巴结合成，不经肾小球滤过，故正常人尿液中含量极低。日本学者认为IgG升高范围与肾小球破坏程度呈正相关，且在DN早期，Malb正常时IgG已明显升高，对早期DN诊断有意义。IgG 4个亚型中IgG4带负电荷，当电荷屏障受损时，可见IgG4与白蛋白排泄率呈正相关，特别是IgG4/IgG之值意义更大，在DN晚期，由于肾小球机械屏障损害，IgG排出增多，IgG4/IgG之值下降。因此IgG4、IgG4/IgG之值可反映早期DN电荷屏障的损害。
IgM是分子量较大的免疫球蛋白(分子量为120)，尿中IgM的出现往往反映肾小球滤过屏障严重受损[8]。Rafid等[9]对139例1型糖尿病患者进行了长期随访(平均随访期18年)，发现患者的生存率和肾脏存活率与白蛋白排泄(RR=2.9/5.8)和尿IgM排泄有关(RR=4.6/5.7)，分层分析提示，不同程度的蛋白尿患者心血管疾病的死亡率和ESRD的发生率随着尿IgM排泄的增多风险显著增高(3倍左右)。DN患者无论是早期还是晚期，尿液IgM排泄增加，其心血管病死亡率和肾衰的风险性均显著提高，提示尿液IgM的排泄是DN患者心血管疾病死亡率及ESRD独立预测因子。
1.3 尿足细胞相关生物标志物
近大量研究表明，足细胞损害在DN发生发展中起非常关键的作用。一方面，DN进展过程中高糖、高血脂、糖基化终末产物(AGEs)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、活性氧簇(ROS)、转化生长因子β(TGFβ)和机械应力的增加对足细胞直接造成损伤,导致足细胞密度减少、体积增大和足细胞特异性蛋白表达改变[10];另一方面,足细胞作为肾小球滤过屏障的重要组成成分,其形态结构及相关分子改变必然促进蛋白尿的发生[11]。Jennifer等[12]通过对OVE26转基因糖尿病大鼠研究发现，足细胞改变可能在DN失代偿期才增加滤过屏障的通透性。
足细胞位于肾小球毛细血管外侧，故当肾小球受损时足细胞脱离肾小球基底膜，在尿中可检测到。有学者认为，尿液中足细胞检测有助于对肾小球损伤严重程度的判断，但其技术复杂。近年来人们通过对足细胞标记蛋白和基因的检测，有可能更加便捷地了解DN不同阶段足细胞的损害。
nephrin是裂孔隔膜上发现的个跨膜蛋白，由足细胞表达、构成裂孔隔膜拉链样结构，与podocin、CD2AP组成复合体，维持裂孔隔膜结构的完整，阻止蛋白滤出。研究发现，DN患者肾小球nephrin mRNA表达减少，引起足细胞损伤脱落，滤过屏障功能破坏，通透性增加，尿蛋白排出增加[13]。Wang等[14]通过检测DN患者尿沉渣中足细胞相关分子(nephrin、podocin和synaptopodin)的mRNA，发现其表达升高，应用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和AngⅡ受体阻滞剂(ARB)治疗后，逆转录定量聚合酶链反应(qRTPCR)证实尿液沉渣中nephrin mRNA排泄减少，尿液中podocin表达的改变可能与DN预后有关[15]。
1.4 尿Smad1

DN主要的形态学改变是肾小球基底膜(GBM)增厚和系膜基质扩张，Takeshi等[16]在体外实验中证实，Smad1作为胶原4中α1和α2的转录因子可以上调胶原4的表达，活化肾小球硬化相关分子如胶原特异性伴侣热休克蛋白47、骨桥蛋白、1型胶原、αSMA等。链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠在24周系膜基质扩张，肾小球Smad1表达升高与系膜基质扩张程度一致。肾小球Smad1表达与肾小球胶原4和αSMA表达一致，而蛋白尿、GFR与系膜基质扩张无关。表明Smad1可以上调胶原4和αSMA的表达，而胶原4是系膜基质扩张的重要组成物质，因此Smad1在DN系膜基质扩张中起重要作用。他们认为Smad1可能比Malb更好地预测DN的系膜基质扩张，可以作为DN系膜基质扩张的诊断标志物。
Akira等[17]对STZ诱导糖尿病小鼠和db/db糖尿病大鼠尿液Smad1水平进行观察，发现4周时小鼠尿Smad1水平与24周时系膜基质扩张相关，而蛋白尿与系膜基质扩张无明显相关。Olmesartan(奥美沙坦)治疗可显著改善肾小球硬化和降低尿Smad1水平。同样地，在db/db大鼠，6周时尿Smad1与18周时系膜基质扩张有关。因此认为糖尿病早期阶段尿液Smad1的增加与肾小球硬化有关，Smad1可作为新标志物预示DN晚期出现的系膜扩张。
虽然很多报道都提及Smad1的激活机制，但是只有相当少的报道提示相关因子可以上调Smad1的表达，如AGEs与糖尿病肾小球Smad1的表达呈正相关[16]。Takeshi等[16]同样发现在糖尿病大鼠中肾小球TGFβ和激活素受体样激酶1(ALK1)的表达增加，但是没有发现TGFβ和ALK1与肾小球Smad1表达有直接关系。
1.5 尿液炎症标志物
传统认为代谢和血流动力学改变是导致DN损伤的主要原因，现在越来越多的证据表明，炎症因子介导的免疫反应在DN发展进程中起重要作用[18]。多种细胞，包括白细胞、单核细胞和巨噬细胞，还有其他一些分子如趋化因子(单核细胞趋化蛋白1，MCP1)、黏附分子(细胞间黏附分子1，ICAM1)、酶类(环氧酶2，COX2;一氧化氮合酶，NOs)、炎症因子(血管内皮生长因子，VEGF;生长激素，GH;胰岛素样生长因子，IGF;TGFβ)和核因子(核因子κB，NFκB)都与DN进程有关[19-21]，但是炎症因子对糖尿病患者肾损伤的作用机制知之甚少。在众多的炎症因子中白介素(IL)1、IL6、IL18和TNFα与DN进展的关系较为明确[21]，其对DN并发症的进展也有多种作用，它们在微血管病变中有时甚至起着决定性的作用[22-23]。此外，流行病学调查显示炎症参数可以很好地预测DN进展。
Wolkow等[24]用Luminex 100 platform联合酶联免疫法(ELISA)的方法检测1型糖尿病合并Malb患者尿液标本中IL8、干扰素γ诱导蛋白10(IP10)、MCP1、IL6、巨噬细胞炎性蛋白1δ(MIP1δ)5种尿炎症标志物，发现肾功能下降者上述5种炎症因子的浓度均高于肾功能正常者。多变量分析提示,两种标志物同时升高时肾功能受损的风险会增加5倍。提示肾脏炎症在1型DN的进展中起重要作用。
Tesch[25]认为MCP1/CCL2是DN肾脏炎症、损伤、纤维化的始动者，尿MCP1水平可以用来评估糖尿病肾脏炎症程度，可能对新疗法或联合治疗效果评估有诊断价值[26]。此外，在啮齿动物上做的基因缺失和分子阻断实验证实MCP1是阻断2型糖尿病进展的重要治疗目标。还有证据表明人类MCP1基因多态性与DN进展密切相关，这可能预示这些基因是DN的危险因素[27]。
2 DN诊断中的新技术
蛋白质组学(proteomics) 以蛋白质组学技术为手段，比较正常肾脏组织与病变肾脏组织中蛋白质水平的差异，或健康者尿样/血浆与肾脏病患者尿样/血浆中蛋白质水平差异，大大提高了DN诊断的阳性率，并有助于理解病理生理学机制。蛋白质组学技术包括蛋白质分离和鉴定技术。二维凝胶电泳(2DE)是蛋白质分离的基本方法，电喷雾质谱(ESIMS)和互助辅助激光解吸、离飞行质谱(MALDITOFMS)技术是蛋白质鉴定的核心技术，它的特点是高灵敏度、快速、直接提供样品的分子量和结构信息并可与色谱连用。Kiga等[28]利用这一技术观察到,在2 000～10 000 Da范围内伴有DN的自发性糖尿病WBN/Kob大鼠血浆中显示80个峰，与对照的Wistar大鼠相比，其中质量电荷比(m/z)为4 678、4 732、4 808、9 058、9 323和9 465的蛋白峰强度高，使用Hachimijiogan后血糖水平没有改变而DN改善，上述差异表达蛋白质峰同时发生改变，而m/z为5 067、5 279、7 598和7 917的质谱峰没有改变。研究结果提示m/z为4 678、4 732、4 808、9 058、9 323和9 465的蛋白质可能参与DN的发生发展,且与achimijiogan的治疗靶点有关。
Sanju等[29]应用蛋白质组学技术构建蛋白质数据库，以建立DN预测体系。他们用2DE法从32例患有局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、狼疮肾、膜性肾病或DN的患者中分离出两种尿蛋白。其中16例患者的尿蛋白被用来构建这个数据库，用另外16例患者的尿蛋白验证预测体系的准确性。结果表明此方法诊断以上疾病的敏感性在75%～86%之间，特异性在92%～76%之间。Kasper等[30]在305个病例中，通过毛细管电泳法及电板离子化质谱分析法，用盲法定义并证实了一组由40种生物标志物构成的数据，可将糖尿病患者从正常人中区分出来(敏感性89%，特异性91%)。在这些糖尿病患者中，糖尿病伴正常蛋白尿患者与DN患者有102种尿生物标志物有显著差异，一个包含了其中65种生物标志物的模版可以极其灵敏地识别DN(敏感性97，特异性97%)，并将DN和其他慢性肾脏疾病区分开来(敏感性81%，特异性91%)。这个研究显示，应用蛋白质组学技术进行尿蛋白分析可以为DN提供早期诊断。
3 展 望
DN生物标志物研究对于早期诊断DN具有非常重要的价值，尽管目前已经发现许多具有潜在价值的DN诊断生物标志物，但其对DN进展的预测价值尚未经过循证医学实验验证。虽然蛋白质组学技术已初步应用于DN生物标志物的研究，但仍存在许多技术性问题，如正常尿液蛋白含量低，对其浓缩技术还不完善;对不同疾病状态下尿液分析还缺乏充分的标准图谱等。随着技术不断改进，相信不久的将来，人们必将发现更多与DN病理生理过程密切相关、并能够准确预测DN疾病进展和严重程度的生物标志物，从而为DN早期诊断和治疗提供更多有价值的生物学信息。