微波辅助萃取-大孔树脂分离纯化龙胆苦苷的研究

【摘要】  目的建立萃取和纯化龙胆中龙胆苦苷的优化参数。方法以龙胆苦苷含量和解吸率为指标，采用微波辅助萃取、大孔树脂吸附纯化和高效液相色谱法测定龙胆苦苷的含量。结果微波辅助萃取优化条件：萃取剂60%乙醇，流速3 ml·min-1；大孔树脂分离富集优化条件为：上样速度2.0 ml·min-1，洗脱液50%乙醇，流速1.0 ml·min-1时分离纯化效果好。结论 在优化的萃取、纯化条件下制得这批龙胆原料龙胆苦苷平均含量为34.57mg·g-1。

【关键词】  微波辅助萃取 HPD-100大孔树脂 龙胆 龙胆苦苷

　　Abstract:ob[x]jectiveTo investigate the optimum parameters of extraction and purification of gentiopicrin in Gentiana scabra Bunge. MethodsMicrowave-assisted flow and macroporous absorptive resin were employed respectively in the extraction and purification processes. The content of gentiopicrin in the fractions was evaluated by HPLC. ResultsThe appropriate extraction conditions were: extractant concentration 60%（V/V）ethanol, flow rate 3 ml·min-1. When the flow rate of sample was 2.0  ml·min-1, the eluant was 50% （V/V）ethanol and flow rate was 1.0 ml·min-1, the effect of separation and purification was satisfactory. ConclusionUnder the above optimum conditions the content of gentiopicrin was 34.57mg·g-1 from this batch of Gentiana scabra Bunge.

　　Key words:Microwave-assisted flow extraction;   HPD-1001 macroporous resin;   Radix Gentianae;  Gentiopicrin
    
　　龙胆Gentiana scabra Bunge是一种常用中药，有清湿热、利肝胆的功效，龙胆中含有的主要成分为裂龙胆苦苷苷类苦味成分，如龙胆苦苷(gentiopicrin)、当药苦苷(swertiamarin)、当药苷(sweroside)等龙胆苦苷成分，研究表明龙胆苦苷为其主要活性成分，具有保肝、利胆、健胃、抗炎、抗菌等活性［1］，是评价龙胆质量标准重要指标。微波辅助萃取(Microwave assisted extraction, MAE)与传统的索氏萃取方法比较，MAE能够缩短萃取时间，减少能耗及溶剂用量，在大部分情况下能够提高萃取产率。而大孔吸附树脂具有良好的吸附性及一定选择性，在中草药有效成分的分离纯化方面得到广泛应用［2］。

    本文以龙胆中的主要成分龙胆苦苷含量为指标，结合MAE和大孔树脂优点，初步考察影响微波萃取和大孔树脂分离富集龙胆中龙胆苦苷成分的参数。

　　1  器材

    龙胆采自丽水市郊大山峰，海拔1 500 m左右，经李水福中药师鉴定为龙胆Gentiana scabra Bunge.，去梗，60℃恒温烘干，粉碎，过40目铜筛得试样；龙胆苦苷对照品（批号110770-200510，中国药品生物制品检定所）；HPD-100大孔树脂（沧州宝恩化工有限公司）；Agilent1100高效液相色谱仪，20 μl定量进样环；流动微波提取装置：将WD800TL23-K3型格兰仕微波炉进行改造，在微波炉侧面开两个间距9 cm、直径为0.5 cm孔；乙醇(分析纯)，甲醇(色谱纯)。

　　2  方法与结果

　　2.1  试样中龙胆苦苷含量测定

　　Agilent ZOBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱；检测器DAD，参照文献［3］选择色谱条件为：检测波长270 nm；柱温25℃；流动相：甲醇-0.4%磷酸(10:90→60:40,0→30)；流速1.0 ml·min-1。准确称取在P2O5干燥12 h的对照品9.4 mg，用甲醇-0.4%磷酸（1+1）溶解并定容至10ml，混匀，分别吸取0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml于5ml容量瓶中，甲醇-0.4%磷酸（1+1）定容，每份平行测定3次，求峰面积均值，以峰面积均值A为纵坐标，龙胆苦苷质量浓度X为横坐标进行线性回归，得回归方程：A=27 463X+70 451，r=0.997 4，线性范围：0.94～7.52 μg。在相同色谱条件下分析各试液，以外标曲线法计算各试液中龙胆苦苷含量。

　　2.2   微波协助萃取龙胆苦苷成分

　　2.2.1  乙醇浓度对萃取率的影响

　　准确称取由四分法所得适量的试样1.52 g，放入提取管（内径约12 mm），提取管上下用玻璃棉封好，放入改造后的微波炉内进行微波提取，微波输出功率为480W（中火档），占空比为40%。用蠕动泵以3.0 ml·min-1流速各次将10%，30%，50%，75%，95%浓度（体积分数，下同）乙醇溶液30 ml泵入提取管内，开微波炉，收集萃取液，萃取完成后，关闭微波炉，继续泵入5 ml原乙醇溶液淋洗，淋洗液合并到萃取液中，经旋蒸浓缩干燥后采用HPLC 法测定龙胆苦苷含量，结果如图1。从图1看出，当乙醇浓度50%与75%时萃取率佳，结合经济成本，确定萃取液为60%乙醇。

　　2.2.2  萃取剂流速的影响

　　改变萃取剂流速，分别泵入60%的乙醇30 ml，收集萃取液并用HPLC法测定，结果如图2所示，随萃取剂流速的增加，目标成分被萃取量先逐渐增加，当流速3ml·min-1(即萃取时间为10 min)时，萃取量达大。

　　2.2.3  萃取剂体积的影响  
 
　　称取试样1.35 g，选萃取剂流速3.0 ml·min-1，每次收集3 ml萃取液，共15 次，测定各份萃取液中龙胆苦苷含量，结果表明第1份到第4份萃取液中龙胆苦苷含量均高，第5份开始下降，到第9份、第10份时龙胆苦苷含量很低了，说明大部分目标成分在30 ml内萃取完成，因此确定萃取剂体积30 ml，萃取剂体积与试样质量比值约为22∶1。

　　2.3  大孔吸附树脂分离纯化龙胆苦苷

　　2.3.1  大孔吸附树脂动态吸附量的测定

　　经大孔吸附树脂预试验，以HPD-100型大孔吸附树脂对龙胆苦苷的吸附能力较好。取以上预处理好的树脂4份各5 g ，湿法装柱（1.0 cm×15 cm），按文献［4］方法预处理好。取萃取优化参数下所得提取液，减压旋干，蒸馏水溶解，转移到100 ml容量瓶并定容，每份含龙胆苦苷约110 mg，上柱，上样速度依次为1.0，1.5，2.0，2.5 ml·min-1，按《中国药典》2005 年版Ⅰ部龙胆薄层鉴别方法检测，与龙胆苦苷对照品比对，刚出现斑点即停止上样，根据剩余试液量求得各流速下动态饱和吸附量依次为19.48，18.57，18.12，16. 31 mg/g干树脂，考虑时效因素，确定上样速度2.0 ml·min-1。

　　2.3.2 洗脱液乙醇浓度的确定

　　按2.0 ml·min-1上样速度处理大孔吸附树脂柱5份，先饱和吸附，然后用蒸馏水洗脱至洗脱液还原糖反应(Molish 反应)为阴性，再分别用10%，30%，50 %，75%，95 %乙醇溶液以2.0 ml·min-1流速洗脱，薄层跟踪检测，收集洗脱液，按HPLC法测定各收集液中龙胆苦苷量，参照文献［5］计算解吸率，结果如图4。从图4可知，由于10%，30%乙醇溶液极性较大，洗脱能力有限，不能使吸附在树脂上的龙胆苦苷完全解吸，50%乙醇溶液则能使龙胆苦苷等快速解吸，故确定50%乙醇溶液为洗脱液。

　　2.3.3 洗脱液流速的影响

　　分别取10 g预处理好的树脂4份，湿法装柱，以2.0 ml·min-1速度上样，饱和吸附，以50%乙醇溶液在1.0，1.5，2.0，2.5 ml·min-1流速下洗脱，薄层检测，收集流出液，HPLC法测各收集液龙胆苦苷量，计算解吸率，结果如图5。洗脱流速直接影响到洗脱液和树脂的交换时间，流速太快，两者接触时间短，未能充分解吸而增加了洗脱剂用量，从而增加了操作成本和后续浓缩成本；流速慢，虽解吸效果好，但操作周期加长，增加了生产成本。图5表明，洗脱流速0.5～1.0 ml·min-1时洗脱效果好，考虑操作效率，选择洗脱液流速1.0 ml·min-1。

　　2.4  验证实验按“2.2”方法所得优化萃取参数制备龙胆提取液3份，每份含龙胆苦苷100～110 mg，分别上3个预处理好的大孔吸附树脂柱，在优化的分离纯化条件下进行吸附与解吸，HPLC法测定收集液中龙胆苦苷量。结果表明HPD100大孔吸附树脂平均动态吸附量为19.07 mg/g干树脂，平均解吸率93.5%，依此制得这批龙胆原料龙胆苦苷平均含量为34.57 mg·g-1。

　　3  讨论

    微波协助萃取中萃取剂乙醇浓度是影响微波萃取效果重要因素，它不仅影响试样对微波的吸收，而且影响目标物的溶出，是提高萃取率和萃取选择性的重要因素；其次，萃取剂流速也是较重要的因素，因为当提取管体积一定时，流速越大，受微波辐射时间越短，就不能充分地与渗入试样中的萃取溶液形成浓差扩散，另外适宜的流速也有利于降低成本。在分离纯化龙胆苦苷过程中，上样速度不能太快，以免上柱液中目标成分不能充分地被树脂吸附而过早渗漏，不能形成动态饱和吸附平衡；要控制好洗脱液的极性，保持其适宜洗脱能力，既能把绝大部分目标成分解吸下来，又不能洗脱下过多的杂质而影响产品纯度。如果能把微波辅助萃取与大孔吸附树脂分离纯化偶联起来，一定会有广阔的应用前景。

【参考文献】
  　　［1］徐国钧.中国药材学［M］. 北京：中国医药科技出版社,1996：365.

　　［2］闫 磊，何再安，刘焱文. 大孔吸附树脂在中药研究中的应用［J］.时珍国医国药,2006：17（12）：2585.

　　［3］侴桂新，王峥涛，董婷霞，等. 龙胆药材中龙胆苦苷的含量测定［J］.上海中医药杂志，2005，39(11)：53.

　　［4］贾存勤，李阳春，屠鹏飞，等. HPD系列大孔吸附树脂预处理方法研究［J］.中国中药杂志, 2005,30(18)：1425.

　　［5］朱 浩，侯世祥，孙毅毅，等. 大孔吸附树脂吸附纯化不同中药有效部位特性研究［J］.中国中药杂志, 1998,23(10)：607.

作者：王良贵