光学性全厚板层角膜移植术治疗真菌性角膜炎的初步探讨

作者：陈蔚，张京娜，孙莉，王世明，马慧香，张晓博    作者单位：1.温州医学院附属眼视光医院，浙江 温州 325027;2.杭州市下沙医院 眼科，浙江 杭州 310000;3.福建泉州市妇女儿童医院 眼科中心，福建 泉州 362000

【摘要】  目的 初步探讨完全钝性分离的光学性全厚板层角膜移植术治疗真菌性角膜炎的可行性、安全性和增视效果。方法 采用前瞻性非对照研究，对临床确诊为真菌性角膜炎且常规抗真菌药物治疗无效的患者行活体激光共焦显微镜检查，对其中明确菌丝未累及角膜深基质及后弹力层的21例患者(21眼)行完全钝性分离的光学性全厚板层角膜移植术。术后第1周、第1个月、第3个月、第6个月、第12个月和第18个月常规随访，观察角膜植片上皮愈合情况、有无真菌复发、免疫排斥反应、移植片透明度和佳矫正视力等;术后第6个月和第12个月复查角膜内皮细胞密度。结果 术前激光共焦显微镜检查，21只患眼均找到真菌菌丝，未见菌丝累及角膜深基质及后弹力层;术中无一例因后弹力层穿破而改行穿透性角膜移植术;仅1例在术后2周内出现真菌复发，复发率为4.76%。其余20例平均随访(14±6)个月，角膜植片均透明，治愈率为95.24%。术后第6个月，有14例术眼佳矫正视力≥4.5，其中5例≥4.8。术后第6个月，平均角膜内皮细胞密度为(2296±368)个/mm2(1025~3491个/mm2);术后第12个月为(2337±357)个/mm2(1016～3380个/mm2)。结论 光学性全厚板层角膜移植术是一种治疗真菌性角膜炎的有效手段，激光共焦显微镜有助于真菌的诊断和真菌浸润深度的判断，完全钝性分离的方法减少了前房穿孔率，提高了手术的成功率。

【关键词】  共焦显微镜;真菌性角膜炎;板层角膜移植术

Preliminary investigation of optical full-thickness lamellar keratoplasty for fungal keratitis

　　CHEN Wei*， ZHANG Jingna， SUN Li*， et al.

　　* Hospital of Ophthalmology and Optomery， Wenzhou Medical College，Wenzhou China， 325027

　　[Abstract] ob[x]jective To investigate the efficacy and safety of optical full-thickness lamellar keratoplasty (OFLK) with cryopreserved donor corneas in the treatment of fungal keratitis. Methods OFLK was performed on 21 eyes of 21 patients with fungal keratitis that had not been cured by antifungal chemotherapy. Fungal hyphae and the infiltrating depth in all 21 corneas were confirmed by laser confocal microscopy before surgery. During the surgery， corneal stroma was removed and Descemet membrane was exposed by a completely blunt dissection with the use of a very fine forceps tip and a fine blunt spatula. Visual acuity， corneal clarity， and endothelium cell density were assessed at different time points after surgery. Results Fungal hyphae were imaged in all of the 21 patients and no filaments were found infiltrated in the deep stroma and Descemet membrane preoperatively. No intra-operative perforation of Descemet membrane occurred during surgery. Twenty cases resulted in the successful cure of fungal infection and were followed up for (14±6)months. Only one eye (4.76%) had a recurrence of the fungal infection within 2 weeks. The best-corrected visual acuity(BCVA)of 14 cases was above 4.5， 5 of which were above 4.8 at 6 months after surgery. Overall， mean endothelium cell density was (2337±357)cells/mm2 (range 1016～3380 cells/mm2) at 12 months after surgery. Conclusion OFLK is a safe and effective therapy for restoring visual acuity in the treatment of fungal keratitis. Laser confocal microscopy is helpful in the diagnosis of fungal keratitis and in judging the depth of the filament infiltration. Blunt separation decreases the percentage of intra-operative perforation of Descemet membrane.

　　[Key words] confocal microscopy; fungal keratitis; lamellar keratoplasty

临床中累及角膜缘或者是大面积的真菌性角膜溃疡是眼科常见的致盲性疾病，其治疗十分棘手。应用新鲜供体角膜材料的穿透性角膜移植术(penetrating keratoplasty，PKP)是目前有效的复明手段，但由于缺乏足够的新鲜供体角膜材料，并且大植片移植和偏心移植容易发生严重排斥反应以及有其他诸如眼内感染、青光眼等与急性炎症期和穿透手术相关的严重术中、术后并发症，不能达到理想的治疗效果。我们使用甘油保存的供体材料，开展钝性分离的光学性全厚板层角膜移植术(optical full-thickness lamellar keratoplasty，OFLK)治疗严重的累及角膜缘和大面积的真菌性角膜溃疡，取得了显著的效果，现报告如下。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料　 2005年7月至2007年2月期间， 在我院就诊的经抗真菌药物治疗无效的真菌性角膜炎患者中，选择经激光共焦显微镜检查明确菌丝未浸润至角膜深基质和后弹力层的患者21例(21眼)，进行光学性全厚板层角膜移植术。其中男性15例，女性6例，年龄28～56岁，平均(43±14)岁。发病相关因素：有植物性外伤史者15眼，有隔夜配戴角膜接触镜史者2眼，原因不明者4眼。溃疡处刮片取坏死组织行10%氢氧化钾湿片检查，有14例找到菌丝。

　　1.2 活体激光共焦显微镜检查方法 激光共焦显微镜(德国海德堡公司生产)是由海德堡视网膜激光断层扫描系统Ⅱ代(HRT-Ⅱ)和Rostock角膜模块组件组成。激光波长为670 nm，分辨率为1 μm。操作步骤： 用0.5%爱尔凯因滴眼液表麻2次，开睑器开睑，在显微镜物镜前端滴用Vidisic眼用凝胶，盖上一次性无菌角膜接触帽，分别在溃疡边缘4个象限各选取1处及溃疡中央1～2处进行检查，调整物镜位置使接触帽与角膜轻接触，将镜头缓缓前移，角膜各层的扫描图像即可通过电脑显示器快速显示，可拍摄静态截图或连续动态图像，发现菌丝后逐层追踪至菌丝末端，明确菌丝有无累及角膜深基质及后弹力层，图片可由打印机打出(见图1)。

　　1.3 术前情况 术前视力及病灶位置：21例角膜溃疡均累及视轴区，视力为眼前手动至4.0。病灶大小：角膜溃疡直径>8.0 mm者5例，6.0～8.0 mm者10例，<6.0 mm者6例，其中累及角膜缘的偏中心溃疡7例。前房情况：16例可见前房线状或1～2 mm渗出性积脓，其中3例合并有角膜内皮斑。

　　1.4 手术方法 先用环钻小心钻切受体角膜，尽量达到角膜厚度的2/3以上，确保周边完全包括了病变组织，继而用显微钩子或15°刀小心拨开后基质，形成一小口袋状，使用虹膜恢复器细端伸入袋状间隙行扇状往复分离，期间也可用虹膜恢复器粗端旋转迂回，加快完成全周剥离，随之以维纳斯剪沿环钻划界剪切，完成初次的板层剖切，此时深度应已达2/3以上。在角膜缘行前房穿刺降低眼压。植床反复冲水后，再次用特制的显微钩在植床边缘钩取水肿的基质纤维，形成能插入虹膜恢复器细端的小袋状间隙，继续使用虹膜恢复器细端伸入袋状间隙行扇状分离，以维纳斯剪进入袋状间隙剪切已分离的基质薄层。一般只需2～3轮的重复板层剥除即可达到后弹力层，此时虹膜恢复器前行时可出现后基质层皱褶。暴露后弹力层后可见表面光滑如镜，无角膜基质层存在时的纤维状发毛的反光，其光洁面与基质间有潜在性的间隙，一经潜入，可轻松地用虹膜恢复器完成360°迂回。取甘油冰冻保存植片，复水后剥除后弹力层和内皮层，10-0尼龙线间断缝合12～16针(见图2)。术后继续静脉滴注氟康唑200 mg/d，共7 d，局部滴用抗真菌眼药水，2周后对无真菌复发感染者局部应用1%的环胞霉素A眼药水。

　　1.5 角膜片病理检查　 将术中取下的病变角膜行高碘酸-Schiff染色(periodic acid-schiff stain，PAS)，做病理检查。

　　1.6 术后随访 术后第1周、第1个月、第3个月、第6个月、第12个月和第18个月按常规随访，观察角膜植片上皮愈合情况、有无真菌复发、免疫排斥反应、移植片透明度和佳矫正视力，术后第6个月和第12个月检查角膜内皮细胞密度。

　　2 结果

　　2.1 激光共焦显微镜检查结果 术前21例角膜病灶经激光共聚焦显微镜检查均发现真菌菌丝，逐层追踪菌丝至其末端，未见累及角膜深基质层和后弹力层。

　　2.2 实验室检查结果 术前角膜刮片涂片检查，有14例找到真菌菌丝;术后21例病变角膜PAS染色，均发现有真菌菌丝。

　　2.3 术中及术后早期情况 术中出现微穿孔2例，穿孔率达9.5%(2/21)，未出现因后弹力层破裂而改行PKP术。术后7天内有16例角膜植片上皮完全修复(占76.2%)，19例在术后10天内完全修复(占90.5%)，1例发生上皮修复延迟(>2周)。1例(占4.76%)在术后2周内出现真菌复发，植床植片边缘上呈小片状浸润并在植片与植床间蔓延，行PKP术后治愈。其余20例术后3～5 d角膜植片水肿，层间轻度混浊，1周后植片基本恢复透明，层间混浊逐渐消退。

　　2.4 术后视力情况 术后第6个月佳矫正视力：5眼≥4.8，9眼在4.5～4.8间，5眼在4.1～4.5间，1眼因并发性白内障致视力为3.8。术后第12个月仍在随访的12例患者术眼佳矫正视力：2眼≥4.8，6眼在4.5～4.8间，4眼在4.1～4.5间。

　　2.5 术后远期效果 除1例术后复发的患者改行PKP术外，仅2例大植片和1例偏中心移植的患者，术后第2个月时出现植片水肿混浊，少量新生血管长入，考虑为基质型的免疫排斥反应，及时给予全身和局部糖皮质激素治疗后，角膜植片在 1周内恢复透明，新生血管消失。术后第3～第6个月，2例大植片移植患者出现角膜上皮型或基质型免疫排斥反应，经局部和全身糖皮质激素治疗及1%环孢素A眼液滴眼后，免疫排斥反应在1周内得到控制，角膜植片透明。术后随访12个月以上的12例患者角膜植片均透明(见图3)。

　　2.6 术后角膜内皮细胞密度 术后第6个月，术眼平均角膜内皮密度为(2296±368)个/mm2(1025～3491个/mm2)。术后第12个月，在访患者12例，术眼平均角膜内皮密度为(2337±357)个/mm2(1016～3380个/mm2)。

　　3 讨论

　　3.1 活体激光共焦显微镜对真菌性角膜炎术前诊断的优势 共焦显微镜具有无创、快速、真菌检查阳性率高等优点[1]。普通的光学共焦显微镜由于穿透力差，在溃疡面较大和基质较水肿时观察不到深层的菌丝，不能判断菌丝浸润的深度以及有无累及后弹力层[2]。而我们所用的激光共焦显微镜以激光代替普通光源，具有分辨率高、穿透力强的特点，即使在角膜水肿的情况下仍能观察到清晰的真菌菌丝，提高了诊断的准确性。在本研究中，激光共焦显微镜检查与术后角膜病理检查更为吻合，弥补了刮片法假阴性率高的缺点。

　　真菌性角膜炎行板层角膜移植术时，对感染浸润的深度进行判断至关重要。以往人们判断感染已经到了内皮面的标准为：后弹力层有自发性穿孔，可见内皮斑，剩余基质仍较混浊以及可见与内皮面相连的前房渗出等[3]，这些仅为术中经验判断，术者并未真正在活体观察到真菌菌丝，术后仍有一定的复发率。而本研究中，图1B-D能很清楚地显示出在活体角膜中随着焦平面的后移，真菌菌丝逐渐减少至后消失。虽然由于角膜水肿、结构破坏，角膜基质本身的结构比较模糊，但菌丝形态仍然清晰可辨并可判断有无累及深基质层和后弹力层，为是否可行OFLK术提供了依据，降低了真菌复发的可能性，减少了不必要的PKP术及其术后并发症。

　　3.2 OFLK术治疗真菌性角膜炎的优势 传统观念认为，对药物不能控制的真菌性角膜炎患者，穿透性角膜移植术(PKP)是治疗及复明的有效手段。但由于国内活性角膜供体严重缺乏，许多患者不能及时手术而丧失眼球，即使有条件行PKP术，由于病程迁延，炎症反应加重，术后也易发生继发性青光眼、并发性白内障、排斥反应等并发症，尤其对于大直径或偏中心溃疡者，PKP术后的并发症更高。也有人用保存角膜先行PKP术控制感染，再行二次复明的新鲜角膜移植手术[4]，但这无疑加重了患者的经济负担，而且多次手术本身使得发生并发症的机会增加。OFLK术与PKP术相比具有以下优势：①可采用保存的角膜材料，材料来源广，利于及时手术，减少病程迁延的并发症。②一次手术达到控制感染和提高视力两个目的，减轻患者经济负担，有利于患者配合治疗。③手术不进入前房，减少了眼内并发症的发生。本研究仅出现1例患者因并发性白内障而影响视力。④术中保留患者自体的角膜内皮，术后无内皮型排斥反应的发生，内皮细胞密度相对稳定，尤其对于大植片或偏心移植的病例具有明显的优势。本研究中的病例一半以上是大植片或偏心移植，虽先后有几例发生上皮型或基质型免疫排斥反应，但经及时全身和局部抗排斥药物治疗后，角膜均较快恢复透明，未对视力造成很大影响，提示我们OFLK术后仍需密切随访，发现问题及时处理，以免造成不可挽回的后果。

　　谢立信等[5]利用部分板层角膜移植术治疗中、浅层真菌性角膜炎，术中仅去除部分角膜基质，术后仍有一定比例的病例复发(7.3%，4/55)。我们采用的OFLK术，病灶清除更，手术适应证较前者广，且术后复发率有所降低(4.76%，1/21)。本研究中复发的1例病例为大范围感染灶，可能与患者病程长、真菌浸润范围大有关，提示我们在抗真菌药物无效时应及时行手术治疗，以免贻误病情。此外，由于植片与植床之间较粗糙，LKP术容易出现角膜基质层间混浊和瘢痕，影响术后视力[5]。而OFLK术中逐层剥除角膜基质至后弹力层，植片植床之间界面光滑，术后瘢痕及新生血管少，视力恢复较好。

　　总之，OFLK 术具有和PKP术同样的远期光学效果，又具有LKP安全、并发症少的优点。

　　3.3 钝性分离的手术方法在OFLK术治疗真菌性角膜炎中的优势 孙秉基等[6]采用空气或黏弹剂注入的方法行OFLK术，发现手术难度大，易穿破角膜， 常有层间积液和植片水肿发生， 从而影响术后近期角膜透明度和增视效果。本研究采用显微钩和虹膜恢复器等器械钝性分离角膜基质层，穿孔率较低，术后层间积液较少，手术安全性明显提高，术后近期的角膜透明度和增视效果较好。在真菌性角膜炎术中，注入空气或黏弹剂可使角膜基质变白、膨胀变厚[6]，干扰术中对感染浸润深度的判断，我们仅用手术器械分离基质，手术创面清晰，减少了手术本身造成的基质混浊，有助于对病灶浸润深度的判断。

　　从本研究的结果看，只有2例患者出现了微穿孔，没有出现大范围后弹力层破裂的情况，说明本手术相对安全。如何避免后弹力层破裂是本手术的关键，注意点如下：?譹?訛术中使用显微钩时，尽量平行于角膜基质床钩起水肿的基质纤维，避免垂直方向上的用力。②在植床还残留少量基质纤维时，一定要通过侧切口释放房水，降低眼内压，从而降低穿破后弹力层的风险。③在分离后基质纤维时，可以通过对植床反复地浇灌低渗透压的注射用水，使基质胶原纤维明显水肿，从而易于去除后的基质纤维。④尽量用钝性的虹膜恢复器进行钝性的分离。

　　本研究只是初步结果，由于病例少、观察时间短，手术的长期效果尚待进一步评价。但依据目前的结果我们认为：激光共焦显微镜有助于真菌的诊断和对侵犯深度的判断，为手术治疗方式的选择提供依据;完全钝性分离的光学性全厚板层移植术是一种安全、有效的治疗真菌性角膜炎的手术方式。

【参考文献】
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　　[2] 谢立信，李绍伟，史伟云，等. 共焦显微镜在真菌性角膜炎临床诊断中的应用[J]. 中华眼科杂志，1999，35(1)：7-9.

　　[3] 李绍伟，谢立信，曾庆延，等. 深板层角膜移植治疗严重角膜真菌感染[J]. 眼科研究，2004，22(3)：259.

　　[4] Yao YF， Zhang YM， Zhou P， et al. Therapeutic penetrating keratoplasty in severe fungal keratitis using cryopreserved donor corneas[J]. Br J Ophthalmol，2003，87(5)：543-547.

　　[5] Xie L， Shi W， Liu Z， et al. Lamellar keratoplasty for the treatment of fungal keratitis[J]. Cornea，2002，21(1)：33-37.

　　[6] 孙秉基，种平，赵东卿，等. 光学性全厚板层角膜移植术远期疗效的分析[J]. 中华眼科杂志，1998，34(1)：11-14.