靶向大鼠CTGF的shRNA表达载体的构建和作用分析

【摘要】  　　目的: 构建并筛选靶向大鼠结缔组织生长因子（CTGF）的shRNA表达载体. 方法: 根据大鼠CTGF mRNA序列设计并构建4个靶向大鼠CTGF基因的shRNA干扰质粒；然后以脂质体转染试剂将目的质粒转染至大鼠心肌成纤维细胞，流式细胞技术分选出成功转染的阳性细胞. 通过RTPCR和Western Blot技术对成功构建的4个shRNA干扰质粒进行有效性筛选，分析其CTGF mRNA及蛋白表达水平. 结果: 酶切证实转录shRNA的目的基因片段已成功克隆入载体，经测序证明与设计的相同；在转染成纤维细胞48 h后，与空白对照组比较，有3组细胞CTGF mRNA及蛋白表达水平明显降低；而转染非特异阴性质粒对照组CTGF mRNA及蛋白表达水平无明显变化. 结论: 成功构建并筛选出靶向大鼠CTGF的shRNA真核表达质粒重组体，为进一步进行体内外心肌纤维化的RNA干扰研究奠定了基础.

【关键词】  结缔组织生长因子;RNA干扰;质粒;转染;心内膜；心肌纤维化

　　Construction of recombinant shRNAexpressing vectors targeting to rat connective tissue growth factor and analysis of its effects

    LANG MingJian1,2, ZENG QiuTang1, GUO Min1, YANG HanDong2, MIN XinWen2

    1Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,  Wuhan  430022, China, 2Department of Cardiology, Dongfeng General Hospital, Yunyang Medical College, Shiyan  442008, China

    【Abstract】  AIM: To construct and screen out the potent shorthairpin RNA (shRNA)expressing plasmids which target to rat connective tissue growth factor (CTGF). METHODS: Four shRNAexpressing plasmids targeting to rat CTGF mRNA (Accession No: NM_022266) were designed and constructed ba[x]sed on the sequence of rat CTGF mRNA. The recombinant plasmids were identified by restriction enzyme assay and nucleotide sequence analysis. Then the plasmids were transfected into rat cardiac fibroblasts using lipofectamine2000 reagent, and the positive cells were sorted by fluorescence active cell sorting (FACS) technique. The mRNA and protein ex[x]pressions of CTGF were analyzed by RTPCR and Western Blot technique, and compared with thatof nontransfection group and negative control plasmid. RESULTS: The 4 recombinant plasmid vectors expressing CTGFtargeting shRNA were identified by restriction enzyme assay and sequence analysis. Fortyeight hours posttransfection, the mRNA and protein ex[x]pressions of CTGF decreased in 3 experimental groups compared with that in nontransfection group, but no changes occurred in negative control plasmid and lipofectamine2000 group.  CONCLUSION: Four recombinant plasmids targeting to rat CTGF are successfully constructed, and 3 potent recombinant plasmids are screened out. This lays a foundation for further researches of RNA interference on cardiac fibrosis in vivo and in vitro.

    【Keywords】 connective tissue growth factor; RNA interference; plasmid; transfect; cardiac fibrosis

　　0引言

    结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）是一种促组织纤维化发生发展的关键细胞因子，在多种器质性纤维化疾病如肾间质纤维化、肝硬化、皮肤瘢痕的形成等中均起关键作用［1-3］. 近年来也有研究提示CTGF可能参与了心肌纤维化的发生［4-5］.

    RNA干扰（RNA interference, RNAi）是转录后水平的基因沉默技术，是比基因敲除、反义寡核苷酸干扰更有前途的作用于mRNA水平的干扰技术，具有相对简单、抑制作用更为完全、特异性高等特点，在高通量研究基因功能、信号转导通路及进行靶向基因静默治疗等方面广泛应用. 本研究通过构建并筛选CTGF靶向特异性的shRNA（shorthairpin RNA）真核表达载体，为今后通过RNAi技术抑制CTGF表达、从基因与蛋白质水平探索CTGF在促心肌纤维化的作用打下基础.

    1材料和方法

    1.1材料真核表达载体pGenesil1质粒和感受态大肠杆菌DH5α购自武汉晶赛生物工程技术有限公司;限制性核酸内切酶BamH I, Hind Ⅲ, Sal I, Pst I和T4多聚核苷酸激酶及其缓冲液均购自宝生物工程大连有限公司;T4 DNA连接酶及缓冲液购自New England Biolabs;凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎生物技术有限公司;脂质体转染试剂lipofectamine2000购于Invitrogen;山羊抗大鼠CTGF多克隆抗体购自Santa Cruz;HRP标记的兔抗山羊二抗及ECL试剂盒购于Pierce公司.

    1.2方法

    1.2.1CTGF靶向性shRNA序列的设计与合成CTGF靶向性shRNA干扰序列的设计合成参见文献［6］. 简言之，从GenBank上选取大鼠CTGF的基因序列(序列号NM_022266)，用专业RNAi设计软件结合个人经验优选四段序列为靶序列，同时设计一对非特异性序列作为对照，并与大鼠基因组进行BLAST比对，验证均为单一基因. 然后进行以上寡核苷酸DNA单链的合成，并退火连接形成双链.

    1.2.2靶向大鼠CTGF的 shRNA表达载体的重组构建及鉴定CTGF靶向性干扰质粒的克隆重组、限制性内切酶分析及测序鉴定参见文献［6］. 首先，线性化处理目的质粒，再把基因片段与线性化质粒连接从而克隆重组成新的靶质粒，随后转化感受态细菌DH5α，在含Kana抗性（终浓度为20 μg/mL）的LB培养液中培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，将提取得到的重组的阳性克隆质粒用Pst I和Sal I进行酶切分析并进行测序鉴定.

    1.2.3大鼠心肌成纤维细胞的分离培养取出生1～2 d的SD乳鼠(购自华中科技大学同济医学院实验动物中心)消毒后无菌操作取心尖组织，剪碎成1 mm3大小，加入适量含0.8 g/L胰蛋白酶和0.5 g/L胶原酶混合液，37℃水浴下机械混匀，完全消化，加入含100 mL/L新生牛血清的DMEM培养液终止消化，离心弃上清，制备成细胞悬液接种到培养瓶，差速贴壁60 min去除心肌细胞，用含100 mL/L新生牛血清的DMEM培养液于37℃, 50 mL/L CO2培养环境中恒温培养. 以后每2 d换液1次，待细胞铺满瓶底后传代继续培养. 取第3代细胞进行后续实验.

    1.2.4心肌成纤维细胞的基因转染及流式分选将培养至第3代的心肌成纤维细胞以1.25 g/L胰酶消化离散，接种于6孔板继续培养，待细胞铺板密度达90%左右时，进行转染实验. 实验分为如下6组：①空白对照组（即单纯细胞组）,②阴性对照HK质粒组,③1号质粒组,④2号质粒组,⑤3号质粒组,⑥4号质粒组. 参照脂质体转染试剂Lipofectamine2000试剂盒操作说明转染细胞. 为纯化转染成功的阳性细胞，于转染后48 h后对所有质粒转染组（1～4号质粒及阴性HK质粒）进行流式细胞分选. 分选出的5组细胞及空白对照细胞进入后续的筛选实验.

    1.2.5RNA的提取及半定量RTPCR检测根据实验分组，在刺激时相点结束后，加入TRIZOL提取细胞总RNA，以30 μL去RNase水溶解，采用紫外分光光度仪测定浓度，利用琼脂糖凝胶电泳检验RNA的质量. RTPCR检测采用两步法进行. 逆转录过程以Random 9 mers为随机引物，AMV为逆转录酶，反应条件为：30℃保温10 min,44℃聚合延伸30 min, 99℃灭活逆转录酶5 min, 5℃稳定5 min. PCR过程以3磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照. CTGF上下游引物序列分别为5′GCTGGGGCTCACCTGAAGG3′和5′GGATGACCTTGCCCACAGCC3′，扩增长度499 bp; GAPDH上下游引物序列分别为5′CCTGACCCAACTATGATGC3′和5′CCCTTACTCCCTGGCTTT3′，扩增长度为343 bp. 引物均用Primer5.0设计，送上海生物工程有限公司合成. PCR反应条件如下：95℃变性5 min； 然后95℃变性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,共计30个循环；后72℃延伸7 min. PCR产物经15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，拍照并经过凝胶成像分析系统对电泳带进行分析，测定各目的基因和GAPDH扩增产物的吸光值，分别计算其比值.

    1.2.6蛋白提取及Western Blot检测根据实验分组，以冰PBS洗涤细胞，按照5×106个细胞加入50uL蛋白裂解液提取细胞总蛋白，蛋白提取液在4℃条件下以12 000 g离心20 min，取上清，采用紫外分光光度仪用Bradford方法测定蛋白浓度后分装，-70℃保存. 取上述细胞蛋白提取液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）. 将电泳分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，置于50 g/L脱脂奶粉的PBS中封闭3 h后分别加入CTGF（1∶400），FN（1∶500）多克隆抗体4℃孵育过夜后，硝酸纤维素膜用3 g/L的TweenPBS液反复冲洗3次，每次15 min. 将冲洗后的膜置于辣根过氧化物酶标记的IgG中，室温下摇床上孵育2 h. 用3 g/L的TweenPBS液反复冲洗3次，每次15 min. 并以兔抗大鼠actin（1∶500）多克隆抗体同上操作，作为上样对照. 抗原抗体复合物用增强化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL）法显影，暗室X光胶片曝光，采用GELW4D软件分析蛋白条带的积分光密度值（integrated optical density, IOD=平均光密度×面积），以IOD靶蛋白/IODactin的比值反映靶蛋白相对水平.

    统计学处理: 用SPSS12.0统计软件对数据进行统计学处理, 数据以x±s表示，多个均数比较用单因素方差分析,两个均数比较用t检验. P<0.05为有统计学差异.

    2结果

    2.1选定的靶序列及针对每条靶序列设计的双链shRNA靶序列结构模式：BamHI+Sense+Loop+Antisense+ 终止信号+SalI+HindIII

    CTGF1: AAGGGTCTCTTCTGCGACTTC; CTGF1A:  5′GATCCGGGTCTCTTCTGCGACTTCTTCAAGACGGAAGTCGCAGAAGAGACCCTTTTTTGTCGACA3′; CTGF1B:  3′GCCCAGAGAAGACGCTGAAGAAGTTCTGCCTTCAGCGTCTTCTCTGGGAAAAAACAGCTGTTCGA5′; CTGF2:   AAAGATGGTGCACCCTGTGTC; CTGF2A:  5′GATCCAGATGGTGCACCCTGTGTCTTCAAGACGGACACAGGGTGCACCATCTTTTTTTGTCGACA3′; CTGF2B:  3′GTCTACCACGTGGGACACAGAAGTTCTGCCTGTGTCCCACGTGGTAGAAAAAAACAGCTGTTCGA5′; CTGF3:   GAGTCCTTCCAAAGCAGTT; CTGF3A:  5′GATCCGAGTCCTTCCAAAGCAGTTCTATGGACAAACTGCTTTGGAAGGACTCTTTTTTGTCGACA3′; CTGF3B:  3′GCTCAGGAAGGTTTCGTCAAGATACCTGTTTGACGAAACCTTCCTGAGAAAAAACAGCTGTTCGA5′; CTGF4:   CCGATGGCGAGATCATGAA; CTGF4A:  5′GATCCGCCGATGGCGAGATCATGAATTCAAGACGTTCATGATCTCGCCATCGGTTTTTTGTCGACA3′; CTGF4B:  3′GCGGCTACCGCTCTAGTACTTAAGTTCTGCAAGTACTAGAGCGGTAGCCAAAAAACAGCTGTTCGA5′.

    以上各序列中画横线部分为正义及反义序列，斜体加粗部分为shRNA的环区序列，两端的框中为BamHI和HindⅢ部分酶切残基，退火成双链后能够形成酶切位点的粘性末端，可与工具质粒相应的黏性末端连接；其余部分为终止信号+SalI. 构建好的质粒重组体分别命名为CTGF1～4.

    2.2心肌成纤维细胞瞬时转染以Lipofectamine2000转染心肌成纤维细胞24～48 h后，倒置荧光显微镜下可见各转染组心肌成纤维细胞在成功转染后可被激发出亮绿色荧光，粗略估测转染效率约30%～40%（图1）.

    图1荧光显微镜下瞬时转染效果×100

    2.3心肌成纤维细胞的流式分选流式细胞分选表明，以Lipofectamine2000进行心肌成纤维细胞的质粒转染，瞬时转染效率仅约为30%（图2）.

    M1:成功转染的细胞比率;  A:阴性对照; B:阳性转染细胞.

    图2心肌成纤维细胞流式分选结果

    2.4不同实验组心肌成纤维细胞CTGF mRNA的表达半定量RTPCR结果显示，序列非特异性的阴性对照质粒成功转染心肌成纤维细胞后对细胞CTGF基因表达无下调效应.4个待筛选的目标质粒转染后，表现出不同的抑制效应，其中在转染1号质粒的细胞未表现出抑制效果，转染2, 3, 4号质粒后有明显抑制效应，尤其以3号质粒基因沉默作用强（图3）.

    2.5不同实验组心肌成纤维细胞的CTGF蛋白表达水平结果显示，序列非特异性的阴性对照质粒成功转染后对细胞CTGF蛋白表达无下调效应；4个待筛选的目标质粒转染后， 1号质粒未表现出任何抑制效果，2, 3, 4号质粒有明显抑制效应，尤其以3号质粒抑制作用强，约75%（图4）.

    3讨论

    CTGF是近年来国内外研究的热点之一， 它可能是TGFβ1促纤维化活性的下游信号介质，刺激细胞增殖及细胞外基质的形成，在组织纤维化中有重要作用. 研究发现在高血压、粥样硬化病变中以及心肌梗死灶中CTGF表达明显增高，并与纤维化指标正相关，提示CTGF可能是致心肌纤维化的关键性中间环节［7-9］.

    通过靶向抑制CTGF从而抑制纤维化的发生和发展理论上是抗纤维化的有效方式，已有研究应用抗CTGF的单克隆抗体FG3019或针对CTGF的反义寡核苷酸用于抑制肾间质纤维化、肺纤维化并取得一定进展［10-11］. RNA干扰（RNAi）是作用于mRNA水平的基因沉默技术,其机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成21～23 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，精确降解与siRNA序列相同的mRNA，抑制了该基因在细胞内的翻译和表达从而达到转录后水平的基因静默［12-15］. 由于siRNA表达载体成功转染后可进行瞬时或稳定的基因沉默，因此相较于化学合成的siRNA更有应用价值和前景. 本研究应用OptiRNA设计软件结合个人经验设计了4条针对大鼠CTGF基因的靶向干扰序列，经BLAST证实与大鼠基因组其他基因无同源性，因此具备了靶向特异性的特点. 我们构建的CTGFshRNA质粒重组体使用了U6启动子启动shRNA的转录以及PolⅢ识别的终止信号终止转录，符合siRNA表达载体的设计要求；通过酶切实验和基因测序也证实目标质粒构建成功. 另外，本质粒含有增强型绿色荧光蛋白编码基因，成功转染后能在细胞内借助U6启动子转录出绿色荧光蛋白，通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪可非常方便的评估转染效率或进行细胞分选，为成功的RNA干扰实验提供支撑.

    由于我们早期进行的预实验发现用脂质体转染试剂Lipofectamine2000对心肌成纤维细胞进行质粒转染其转染效率仅有30%～40%，达不到进行理想的基因干扰实验的要求. 因此，为了提高筛选结果的准确性和可信度，本实验对转染细胞进行了流式分选. 由于分选出的阳性细胞基本上都是已经成功转染目的质粒的心肌成纤维细胞，因此大限度减少了筛选实验假阴性结果的发生.

    通过检测CTGF mRNA与蛋白的表达水平，我们比较了4个目标质粒及阴性对照质粒转染组细胞与非转染细胞的表达差异. 结果表明，CTGF2,3,4号干扰质粒均可有效地抑制CTGF mRNA及蛋白的表达，尤其以3号干扰质粒基因沉默效果更为显著，抑制效率可达75%以上，说明CTGF shRNA可高效特异抑制CTGF的表达. 而CTGF1干扰质粒无明显抑制效率，说明并非所有设计的siRNA均可有效地抑制靶基因的表达，因此，RNA干扰实验要求通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到有效的siRNA序列. 阴性对照组与空白对照组相比CTGF mRNA表达无明显改变，排除了质粒载体本身、非特异性的靶基因对CTGF基因表达的影响.

    综上所述，本研究成功设计并构建了4个靶向CTGF的shRNA质粒，并通过筛选实验获得了高效及靶向特异的目标质粒. 为后续心肌纤维化的体内外RNA干扰研究及进一步探索CTGF在心肌纤维化及心脏的组织重塑中的地位与作用奠定了基础.

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作者：郎明健，曾秋棠，郭敏，杨汉东，闵新文

作者单位：1华中科技大学同济医学院协和医院心内科,湖北 武汉 430022, 2郧阳医学院附属东风医院心内科,湖北 十堰 442008