微板赖氏法酶标仪点对点定量测定丙氨酸氨基转移酶活力

【关键词】 丙氨酸氨基转移酶；无偿献血；微板赖氏法

　　丙氨酸氨基转移酶（ALT）的测定，是对无偿献血者及大量体检时不可缺少的项目之一。目前大多还是采用赖氏试管法来测定，笔者利用酶标仪点对点数据处理系统来建立标准曲线，用微板赖氏法进行测定，既省工、省试剂，也利于原始数据的归档管理，现介绍如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器 MK2型酶标仪；微量加样器；1011型半自动生化分析仪；96孔平底微孔板、电热恒温水温箱、定时针。

　　1.2 试剂 ALT赖氏法试剂（上海荣盛生物试剂厂）。ALT定值血清：x=31.5（购自北京九强公司）。

　　1.3 方法

　　1.3.1 建立标准曲线 按下表加样，每管平行做3份。各加入2,4二硝基苯肼液50 μl充分混匀，在电热恒温水温箱中37℃温育20 min后，各管加入0.8 mol/L NaOH溶液200 μl，充分混匀，静置10 min，在酶标仪上选择基础酶联模式，测量模式以测定波长492 nm，参考波长630 nm，以“0”号管为空白管，计算方式利用点对点（Point to Point）数据处理程序来建立标准曲线并用（SAVE）键保存，依次输入酶活力单位值，平行份数及位置，然后确定，按“Start”键测定，系统自动根据不同酶活力单位与对应的平均A值建立标准曲线。经过分析认为曲线良好，然后按“SAVE”键，选择一个序号将其保存。注意下次建立标准曲线时，可以按上述步骤建立，也可以直接利用“SAVE”键调出原来的标准曲线序号，按“Start”选择建立新标准曲线模式来自动建立。

　　1.3.2 标本测定 在微板上设A1为空白孔，加10 μl磷酸盐缓冲液，50 μl基质液；测定孔加标本10 μl，然后分别加入50 μl基质液，充分混匀，然后再在37℃温育30 min后每孔加入2,4二硝基苯肼50 μl，混匀，37℃温育20 min，每孔加入0.8 mol/L NaOH溶液200 μl，充分混匀室温静置10 min后，在酶标仪基础酶联模式下按“SAVE”键选择序号，调出保存的标准曲线，按“Start”选择“利用旧标准曲线测量模式”直接进行测定，结果ALT酶活力单位直接被打印出来。

　　1.3.3 微板赖氏法点对点测定的准确性估计 从本中心血库无偿献血者标本中随机抽取20份标本，分析用微板赖氏法酶标仪点对点和试管赖氏法来测定ALT，将结果做配对资料t检验，借以估计二者是否存在显著差异，间接评估其准确性。

　　表1 点对点测定的准确性估计（略）

　　1.3.4 微板赖氏法酶标仪点对点测定ALT的精密度估计 在每天日常检验工作中，每天加检一份ALT定值质控血清样品，采用微板赖氏法酶标仪点对点法和试管赖氏法测定ALT，连续20次，计算其标准差与变异系数，判断其精密度。

　　1.3.5 微板赖氏法酶标仪点对点测定ALT重复性估计 从微板赖氏法酶标仪测定的无偿献血者1 390人中，随机抽取25份标本，重复测定，2次结果做配对差值统计分析，判断其重复性。