四种基因甲基化特异性PCR引物设计探讨

【摘要】  目的： 对甲基化特异性PCR(methylationspecific PCR，MSP)引物设计进行探讨。方法： 使用Methyl Primer Express Software Version 1.0软件、“methprimer”和“MSPprimer”的网上在线软件设计的引物以及参照国外文献的MSP引物对CCAAT/增强子结合蛋白ζ（CEBPζ），CCAAT/增强子结合蛋白δ（CEBPδ）、脆性组氨酸三联体（FHIT）和死亡相关蛋白激酶（DAPK）基因启动子进行MSP扩增，然后对其MSP产物进行测序验证以比较MSP引物设计的可靠性。结果： 对于CEBPζ，CEBPδ，FHIT和DAPK启动子基因所设计的MSP引物经MSP后均获得了所需要的目的条带，但经测序鉴定Methyl Primer Express和methprimer设计的CEBPδ，CEBPζ1的MSP扩增产物为假阳性产物，而MSPprimer设计的CEBPζ2的MSP产物为正确序列。结论： MSP引物设计的质量是保证MSP扩增成功的关键因素。
【关键词】  甲基化特异性PCR； 引物； 设计
　　［Abstract］ob[x]jective: To study the primer design of methylationspecific PCR(MSP).Methods： The Primer of MSP was designed using the software of Methyl Primer Express Software Version 1.0,the online software of “methprimer” and “MSPprimer”to amplify CEBPζ, CEBPδ, FHIT and DAPK gene promoters.The MSP assay was established to detect the methylation status of these promoters.Then the MSP products were analyzed in electrophoresis and sequenced. Results： The expected bands were all obtained for all five primer sets.But sequencing revealed that amplification products using CEBPζ1 and CEBPδ primers designed with Methyl Primer Express Software and methprimer were false positive, amplification products using CEBPζ2 primers designed with MSPprimer, FHIT and DAPK primers were correct.  Conclusion： Quality of designed primers was the vital factor for the successful of amplification of MSP.
　　［Key words］methylationspecific PCR； primer； design
    DNA甲基化作为表观遗传学调控方式之一，在X染色体失活、基因组印记、DNA修复和基因表达调控等方面发挥着重要的作用［1］。DNA甲基化主要是指在CpG二核苷酸中胞嘧啶环的第5位碳原子上以共价键的形式结合上一个甲基基团，形成5甲基胞嘧啶（5mC），而基因组的某些特定区域由于富集CpG寡核苷酸则形成了CpG岛（CpG island，CGI）。约50％～70％的人类基因启动子区含有CGI，而在胚胎形成及正常组织中多数CGI是低甲基化的，但在正常组织细胞的定向分化过程中一些关键基因的甲基化可能发挥着重要的调控作用［2］，而在肿瘤细胞的演变过程中一些抑癌基因则发生了高甲基化（hypermethylation）并导致基因转录活性改变，这些改变已被证实与肿瘤的发生发展密切相关［3］。
    目前甲基化特异性聚合酶链反应(methylationspecific PCR,MSP)已被广泛用来研究启动子的甲基化状态。然而，MSP扩增常会产生假阳性结果，导致国际上报道同一基因在同一种肿瘤中异常甲基化的发生率差异极大［4］。因此我们针对MSP的引物作了一些探讨性研究。
    1  方 法
    1.1 DNA提取与修饰 
    取胎盘组织DNA标本1 μg/100  μl，按CpGenomeTM DNA修饰试剂盒（Chemicon公司，加拿大）说明书进行亚硫酸氢盐修饰，经甲基化酶M.SssI处理后再修饰和不经过M.SssI处理直接修饰的DNA分别作为甲基化和未甲基化的阳性模版。
   
　　1.2 MSP检测
    选择4个基因：CCAAT/增强子结合蛋白ζ（CEBPζ） 启动子序列(NCBI序列号NM_004083)；CCAAT/增强子结合蛋白δ（CEBPδ）启动子序列(NCBI序列号NM_005195)；脆性组氨酸三联体（FHIT）启动子序列（NCBI序列号NM_002012）；死亡相关蛋白激酶（DAPK）启动子序列（NCBI序列号X76104）。应用Methyl Primer Express Software Version 1.0（ABI公司）设计CEBPδ的MSP引物；应用“methprimer”（http://www.urogene.org/methprimer/）和“MSPprimer”（http:∥www.mspprimer.org/cgimspprimer/design.cgi）网上在线设计软件设计CEBPζ的MSP引物（CEBPζ1和CEBPζ2）；FHIT，DAPK的MSP引物参照国外文献设计［5,6］，序列见表1。表1  相关基因的引物序列及退火温度（略）
　　MSP反应条件均经优化，其中CEBPζ，CEBPδ和DAPK反应条件为95℃ 5 min, 然后94℃ 45 s，退火温度（表1）45 s，72℃延伸45 s，扩增40个循环, 72℃延伸7 min；FHIT为95℃ 10 min, 然后94℃ 45 s，退火温度45 s，72℃延伸45 s，扩增40个循环, 72℃延伸7 min。以去离子水作为阴性对照。
    1.3 MSP产物克隆测序 
    将PCR扩增的甲基化和未甲基化产物克隆入pGEMT载体中，送上海基康生物技术有限公司克隆测序。
    2 结 果
    5对MSP扩增产物均在预期位置出现了目的条带（图1），去离子水均为阴性。但经过测序鉴定发现CEBPδ和CEBPζ1的MSP甲基化产物为非特异性扩增，而CEBPζ2，FHIT和DAPK的MSP甲基化产物则是正确的扩增序列（图2）。
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3 讨 论
    由于DNA甲基化在肿瘤发生发展过程中的重要作用，一些研究已开始尝试将之用于多发性骨髓瘤、腺癌、肺癌、结直肠癌等的早期检测和诊断［7-11］。MSP以其特异、简便、经济、快速等特点，已经在DNA甲基化检测中得到了广泛应用。该技术将DNA先用重亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，针对修饰前后的序列差异用特异性软件设计甲基化与未甲基引物进行PCR扩增。MSP引物设计中容易出现下列问题：①不能扩增经亚硫酸盐修饰的DNA；②可能同时扩增经亚硫酸盐修饰和未经亚硫酸盐修饰的DNA；③未甲基化引物扩增经亚硫酸盐修饰的DNA未能获得正确的未甲基化产物；④甲基化引物扩增经亚硫酸盐修饰的DNA未能获得正确的甲基化产物。
    因此MSP引物设计必须考虑到以下几个方面：①MSP引物要能区分亚硫酸盐修饰前后的DNA序列，以避免扩增处理不完全的DNA；②引物必须包含几个CpG岛以区别甲基化和未甲基化的DNA，以避免甲基化引物扩增未甲基化模版；③产生非特异性产物的引物必须要剔除，因为被剔除的引物容易产生二级结构或二聚体，降低扩增效率；④导致非特异性扩增的引物必须排除［4］。
    我们发现CEBPδ和CEBPζ启动子存在着甲基化岛，拟对白血病患者中的甲基化态势进行研究。为了确定MSP的特异性，我们设计了CEBPδ和CEBPζ启动子甲基化岛的MSP引物，并选择了目前报道在肿瘤中甲基化发生率较高的2个基因FHIT和DAPK进行验证。结果表明Methyl Primer Express软件和MetyPrimer在线软件未能充分考虑到甲基化PCR的特异性和重亚硫酸盐转变的充分性，设计的引物上包含的CG数量仅为2个，难以区分甲基化产物和未甲基化产物，容易产生假阳性PCR产物；而MSPprimer在线软件所设计的引物扩增序列正确，该软件对亚硫酸盐处理前后序列、甲基化和未甲基化序列的自由能差异考虑得更为充分，且引物序列上一般至少含有3个CG，因而特异性更好。由于要扩增的DNA序列中CG含量相对较高，MSP扩增难度较大，因此设计好的引物好应用引物软件Primer 5.0对引物二聚体、非特异性扩增进行评价，并从理论上预测其引物退火温度（Tm值），从而选择佳引物对。如果退火温度过低则可能引起甲基化引物对未甲基化模板的非特异性扩增。一般来说一对引物的GC含量和Tm值应该协调，引物间的熔融温度Tm的差异不超过2℃，若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5′端加适量的A，T或G，C尾巴。而对于扩增效率<30％的引物要进行优化［12］，其方法是:在核心启动子区域前后反复调整甲基化前导引物扩增起始点,以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。MSP产物终仍需测序以评价引物扩增的保真性。
    总之，一般来说参照国外文献的引物进行研究甲基化的抑癌基因可能少走弯路，但是由于国内外实验室条件的不同，好自行设计引物。我们已经证明未按如上的要求很容易产生假阳性的结果，这个假阳性的结果可能由于未设计好特异性的引物和未找到合适的退火温度造成的。
   
【参考文献】
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