野生型PTEN诱导卵巢癌SKOV3细胞生物特性改变

【摘要】  【目的】 探索野生型PTEN基因对卵巢癌细胞生物学特性的影响。【方法】 将野生型PTEN基因克隆到pAdxsi腺病毒载体并感染SKOV3细胞。荧光镜下检测腺病毒载体对SKOV3细胞的感染效率;用CCK-8法检测细胞增殖的抑制效率;RT-PCR与WB分别检测PTEN mRNA与蛋白表达水平变化;免疫化学法与间接荧光法检测PTEN在细胞内的定位及细胞内NEDD4-1和RAD51等分子表达。 【结果】 稳定转染PTEN后，24 h内PTEN分布于细胞质与核内，而72 h后则主要集中于细胞核内;显著增加细胞质内NEDD4-1和细核RAD51等分子表达。 【结论】 野生型PTEN可影响SKOV3细胞增殖，并诱导细胞表达RAD51与NEDD4-1分子，有利于细胞DNA修复与细胞增殖抑制。
【关键词】  转染; NEDD4-1; PTEN基因
　Abstract： 【ob[x]jective】 To explore the effect of wild-type PTEN gene on biological characteristics of ovarian cancer cells. 【Methods】 The wild-type PTEN gene was cloned into pAdxsi adenovirus vector and infected into SKOV3 cells， the infected efficiency of adenovirus on SKOV3 cells was detected by fluorescence microscopy; the inhibition efficiency on cell proliferation was assayed by CCK-8; RT-PCR and WB was used to detect the level of PTEN mRNA and protein ex[x]pression changes respectively; the location of PTEN NEDD4-1，RAD51 and other molecules in cell were showed by immunochemical and indirect fluorescence. 【Results】 The PTEN could be observed in the cytoplasm and nucleus after 24 h of stable transfection， while after 72 h they could be presented mainly in nucleus; the transfection of PTEN could increase the ex[x]pression of NEDD4-1， nuclear RAD51 molecules significantly in the cytoplasm. 【Conclusion】 The wild-type PTEN can effect the proliferation of SKOV3 cells and induce ex[x]pression of RAD51 and NEDD4-1 molecules， thus would contribute to cellular DNA repair and cell proliferation inhibition.
　　抑癌基因PTEN (phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten)编码的蛋白具有蛋白酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶双重特异性磷酸酶活性及脂质磷酸酶活性，它参与多条细胞内信号通路的转导，调控细胞周期，对细胞的增殖与转化等多种生物学行为有重要作用[1-2]。现已证实该基因不同位点的突变、失活和表达减少与多种肿瘤的发生、发展密切相关， 成为继p53后又一个与多种肿瘤发生发展密切相关的抑癌基因。近期研究显示妇科肿瘤与PTEN基因异常关系密切，其突变和缺失多发于乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等[2]。本研究将野生型PTEN基因通过腺病毒载体导入SKOV3卵巢癌细胞系中，探讨其核内外的表达对卵巢癌细胞生物学功能的影响，为卵巢癌的基因治疗进行初步的探索并提供有意义的参考数据。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料与试剂
　　CCK-8为日本同仁化学研究所产品;胎牛血清购于杭州四季青生物公司;脂质体LipofectamsneTM2000为GIBCO公司产品。质粒pEGFP-N1-PTEN与人卵巢癌细胞株SKOV3由本室保存;pAdxsi腺病毒载体系统、改建的人胚肾细胞293T均为北京诺赛基因公司提供;PTEN和GAPDH引物由北京赛百盛公司合成;兔抗人NEDD4-1(neural precursor cell expressed， developmentally down-regulated 4 isoform 1)、鼠抗人PTEN抗体为美国Santa Cruz公司产品;HRP标记羊抗鼠IgG、HRP标记羊抗兔IgG抗体均购自北京生物技术有限公司;鼠抗人RAD51(DNA repair protein RAD51)购于上海锐聪科技发展有限公司。
　　1.2 pAdxsi-GFP-CMV-PTEN腺病毒载体的构建
　　首先构建pShuttle-GFP-CMV-PTEN重组穿梭质粒：EcoRⅠ/SacⅡ酶切pShuttle-GFP-CMV重组穿梭载体，CIP去磷酸化处理，回收5.1 ku载体片段，同时EcoRⅠ/SacⅡ酶切pEGFP-N1-PTEN回收目的片段;酶连切好的PTEN与pShuttle-CMV-GFP片段(PTEN前后的酶切位点分别是EcoRⅠ与SalⅠ、KpnⅠ和SacⅡ)，得到pShuttle-GFP-CMV-PTEN;转化并扩增，抽提质粒pShuttle-GFP-CMV-PTEN。再构建重组腺病毒载体质粒：Ⅰ-CeuⅠ+Ⅰ-SceⅠ双酶切处理pAdxsi骨架质粒与pShuttle-GFP-CMV-PTEN质粒，切好的两目的片段酶连，产物转化并扩增带pAdxsi-GFP-CMV-PTEN病毒质粒的DH5a;提取pAdxsi-GFP-CMV-PTEN质粒。产物分别进行酶切鉴定与测序。
　　1.3 重组腺病毒包装、扩增和滴度测定
　　293细胞用含100 mL/L FBS的DMEM培养。待细胞长满约80%时，PacⅠ酶切线性化pAdxsi-CMV-PTEN，转染293细胞，3 ～ 5 d后，细胞开始出现细胞病变，待大部分细胞病变并脱落时收获，收集细胞及上清液，反复冻融3次，离心收集上清，用上清继续感染293细胞大量扩增病毒，获取大量病毒液于-80 ℃ 冻存备用;同时测定病毒滴度。
　　1.4 细胞培养与腺病毒转染及其表达
　　SKOV3细胞置于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中常规培养，隔天传代。Adxsi-GFP-CMV-PTEN病毒以100 PFU/cell量加入培养瓶中，作为腺病毒载体实验组(SKOV3/PTEN)，继续培养;同时设立无腺病毒载体感染对照组(SKOV3/CON)与空病毒pAdxsi-CMV-GFP感染的对照组(SKOV3/GFP)，分别于不同阶段收集细胞，提取各组细胞总RNA，行RT-PCR检测目的基因表达情况。引物序列如下：PTEN上游5′-ACCGCC AAATTTAATTGCAG-3′，下游5′-GGGTCCTGAATT GGAGGAAT-3′，扩增片段长度为469 bp;内参照GAPDH上：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′，下：5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′，扩增片段长度为400 bp。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃ × 40 s， 55 ℃ × 60 s， 72 ℃ × 60 s， 28个循环;72 ℃ × 10 min。取10 μL PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳并与Marker比较判断PCR产物片段大小。
　　1.5　PTEN转染对SKOV3细胞生长的影响
　　SKOV3细胞进行PTEN转染后24 h胰酶消化，调整细胞为5 × 104/mL，以0.2 mL/孔移入96孔板， 8孔/板， 按同样方法处理SKOV3/GFP和SKOV3/CON等组细胞。从第2天开始，每天同一时间取一块板，于实验各孔分别加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃继续孵育1 h，测定吸光度值D(450 nm)，根据CCK-8测定结果分析PTEN对SKOV3生长影响。
　　1.6　Western Blot检测
　　分别收集不同时间SKOV3/PTEN组细胞， 裂解细胞并抽提细胞质与细胞核蛋白上清液，跑SDS-PAGE胶，恒压120 V，电泳2 h后用湿转移法，电转印到0.22 μm孔径的PVDF膜上，在为5%脱脂牛奶TBST的封闭液中，室温1 h，TBST漂洗2次;分别加鼠抗人PTEN、兔抗人NEDD4-1与鼠抗人RAD51一抗， 4 ℃振荡过夜。TBST液漂洗数次，每次15 min，加入HRP标记的二抗，室温振荡1 h后漂洗3次， ECL显色。
　　1.7 免疫细胞化学与间接荧光检测
　　各组细胞爬片，进行相应的实验后固定细胞，并行TritonX-100透化，分别加入相应的一抗(兔抗人NEDD4-1、鼠抗人PTEN与RAD51) 4 ℃孵育过夜后，再用HRP标记的二抗孵育，DAB显色;或与CY3-羊抗兔IgG、CY5羊抗鼠IgG等二抗孵育后镜检，以检测细胞中PTEN、RAD51与NEDD4-1等相关分子表达与分布情况。
　　1.8 统计学处理
　　实验数据以3次相同实验结果的均数 ± 标准差(x ± s)表示，用SPSS 10.0进行统计，采用单因素方差分析(one-Way ANOVA)。
　　2 结 果
　　2.1　pShuttle-GFP-CMV-PTEN与pAdxsi-GFP-CMV-PTEN的鉴定
　　pShuttle-GFP-CMV-PTEN EcoR Ⅰ/SacⅡ酶切，阳性克隆将得到5.1 ku和1.3 ku两条带(图1A);而阴性克隆只有5.1 ku一条带。XhoⅠ酶切pAdxsi-GFP-CMV-PTEN，因重组腺病毒载体骨架序列上自带6个XhoⅠ酶切位点，PTEN片段从穿梭质粒上带来1个XhoⅠ酶切位点，因此XhoⅠ酶切阳性克隆后应14、11.8、3.5、2.93、2.47、1.45和0.6 ku等7条带(图1B);而阴性克隆只有14、11.8、4.0、2.47、1.45和0.6 ku等6条带(图1C)。
　　2.2 重组腺病毒的产生和扩增
　　PacⅠ酶切线性化的pAdxsi-GFP-CMV-PTEN重组腺病毒质粒经脂质体Lipofectamine2000转染293细胞72 h后，细胞开始细胞病变效应;5 d后细胞全部悬浮，收集病毒混悬液。
　　2.3 腺病毒滴度测定
　　在重复扩增、收集病毒颗粒后，为了便于病毒感染细胞时能确定病毒用量，本实验采用的是PFU空斑计数法，对病毒滴度进行了计算，得到ADxsi-CMV-PTEN重组腺病毒的滴度为2.5 × 109 PFU/mL;使用同样的方法测定对照组，空载腺病毒ADxsi的滴度为3.5 × 109 PFU/mL。
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2.4 转染后SKOV3细胞内PTEN表达与分布
　　普通显微镜下观察：ADxsi-CMV-PTEN重组腺病毒转染前SKOV3细胞呈圆形，边缘清晰，染色均匀，细胞膜表面稍有隆起，细胞贴壁生长，增殖、生长良好;转染24 h后，荧光镜下可见细胞内表达腺病毒自带的报告基因EGFP(图2A);3 d后SKOV3/PTEN组细胞行PTEN蛋白的免疫细胞化学检测，显示超量表达的野生型PTEN蛋白在细胞核和细胞质中都存在，但PTEN存在于绝大部分细胞质内，少部分细胞核内明显富集了PTEN(图2B，C);进一步行PTEN基因RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，重组腺病毒感染2 d与8 d 后，SKOV3/PTEN组证实于469 bp处扩增的目的条带(图3A)。应用细胞核蛋白提取试剂盒，分别提取Adxsi-GFP-CMV-PTEN转染后2、4、8和16 d的SKOV3/PTEN组细胞的核蛋白进行Western blot检测，PARP核膜蛋白作内参照，结果PTEN蛋白在细胞核内持续表达(图3B)，提示SKOV3/PTEN组细胞显著上调细胞核PTEN水平，与对照组SKOV3/CON和SKOV3/GFP均有显著差异性(P < 0.01)。
　　2.5 转染后SKOV3细胞内相关分子的表达与分布
　　载体感染对照组、空病毒对照组与Adxsi-GFP-CMV-PTEN转染后实验组(SKOV3/PTEN组)的分别进行免疫细胞化学与间接荧光检测，结果载体感染对照组与空病毒对照组的细胞质中NEDD4-1分子有极低水平的表达(图4A)，但RAD51检测不到(图4C);而Adxsi-GFP-CMV-PTEN转染后实验组的细胞质中NEDD4-1表达显著增强(图4B)，在部分细胞核内RAD51分子也显著表达(图4D)。
　　2.6 各组细胞中NEDD4-1与RAD51分子的表达与分布
　　分别采用蛋白提取试剂盒分别提取载体感染对照组、空病毒对照组的实验结果及Adxsi-GFP-CMV-PTEN转染后的实验组(48和96 h)的细胞质与细胞核蛋白，进行Western blot，依次检测细胞质内NADD4-1、细胞核内RAD51分子，GAPDH作内参照，结果空载体感染对照组、空病毒对照组NADD4-1均有低水平的表达，而Adxsi-GFP-CMV-PTEN转染后的实验组(48 h，96 h)表达水平显著升高;同时载体感染对照组、空病毒对照组的细胞内不表达RAD51，但PTEN表达的实验组(48 h，96 h)细胞核内RAD51持续表达(图5)。
　　2.7 PTEN基因转染后对SKOV3细胞的生长的影响
　　CCK-8检测显示：SKOV3/PTEN组相对于SKOV3/CON与SKOV3/GFP组的增殖能力明显降低(P < 0.01)，而SKOV3/GFP组与SKOV3/CON组相比差异无统计学意义(P > 0.05，图6)。
　　3 讨 论
　　PTEN是易突变的抑癌基因之一，是多种细胞生长、分化和维持生存的抑制物，突变或者被敲除后，可能引起前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和脑癌。PTEN蛋白大多位于细胞质中，有时也出现在细胞核。胞质中的PTEN功能已明晰，具有拮抗酪氨酸激酶活性，表现为脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性; PTEN是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)信号传导级联的关键负调节子，其底物磷酯酰肌醇-3， 4， 5三磷酸(PIP3)能特异性地使磷酯酰肌醇D3环去磷酸化，从而拮抗PI3K底物磷酸化，负性调控PI3K/AKT/PKB通路[3-4]。国内外大量研究显示PTEN的失活频频发生于卵巢癌组织中[5-6]，提示PTEN 基因异常与卵巢癌的发生、发展有着密切联系。
　　我们应用pAdxsi腺病毒载体系统构建了携带野生型PTEN基因的重组腺病毒，导入卵巢癌细胞SKOV3，RT-PCR与Western blot结果均证实：Adxsi-GFP-CMV-PTEN转染后PTEN mRNA与PTEN蛋白在细胞中稳定高效表达(见图2，3)。应用CCK-8等检测PTEN对卵巢癌细胞SKOV3的增殖与活性影响，其原理是通过试剂中WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]在电子载体1-Methoxy PMS[1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯]的作用下被细胞线粒体中的乳酸脱氢酶(LDH)还原为具有高度水溶性的甲臢 (Formazan dye)，生成Formazan dye量与活细胞数量成正比的原理而进行细胞增殖分析[7]。从图6可以发现，使用PTEN可以明显抑制细胞生长，表现出抑制肿瘤增殖的活性。
　　细胞的自身网络调控作用常常导致外源性基因表达和或功能受到限制。我们在研究过程中也发现PTEN分子在转染的早期(48 h之内)主要分布于细胞质中，而转染72 h后，则在细胞质与细胞核均有存在，是什么因素导致PTEN分子的异位分布尚不清楚。先前文献认为 NEDD4-1(neural precursor cell expressed， developmentally down-regulated 4 isoform 1)通过泛素化介导PTEN的赖氨酸(Lys)K289以及其他几个位点氨基酸残基等多位点泛素化，过度表达的NEDD4-1增加细胞质内的PTEN降解，抑制PTEN功能而增强细胞转化;同时泛素化还可以调节PTEN在细胞中的定位，单泛素化使PTEN向细胞核运动，并在细胞核中稳定存在[9-10]。细胞核PTEN对抑制肿瘤至关重要，核内PTEN诱导Rad51表达，维持染色体稳定和调控DNA修复。我们在检测细胞内NEDD4-1的表达情况时发现，当Adxsi-GFP-CMV-PTEN转染后24 h，细胞质内NEDD4-1开始上调表达，而48 h后，细胞核内的PTEN水平显著增高，甚至出现部分细胞核浓集现象，我们推测可能是因细胞质PTEN过表达而诱导细胞应激性增加NEDD4-1水平来调控细胞内PTEN的水平与PTEN再分布，这一方面可以诱导细胞内过表达的PTEN降解，另一方面也可促进细胞质内的PTEN分子通过单位点泛素化而进入细胞核发挥其生物学功能，但NEDD4-1被怎样调节、NEDD4-1介导的PTEN泛素化而导致细胞质内PTEN的大量丧失有哪些组织和生理学背景;泛素化PTEN进入细胞核内是由扩散引起的被动运输、还是由PTEN C末端的细胞核定位信号引起的主动运输、或由N末端细胞核定位结构域以及多种细胞核排出基序介导的依赖于Ran的输入均不清楚，有待进一步深入研究。
　　为探索细胞核内的PTEN或是泛素化的PTEN是否具有生物学功能，我们检测了与PTEN功能密切相关的分子RAD51。结果显示：当外源性PTEN进入细胞核后，核内开始可检测到RAD51分子表达。基因组稳定与否是肿瘤产生的重要原因之一，而基因组的稳定受控于许多机制，其中之一是染色体同源重组机制，而RAD51是染色体同源重组和DNA双链断裂点(DSB)修复的必须组分之一，RAD51的参与可使细胞中DNA双链断裂点(DSB)减少，在受损DNA无差错修复行为中发挥核心作用[10-11];同时亦参与维持正常细胞周期[10-12]，所以核内高水平的PTEN分子对染色体异位等差错以及维持正常细胞周期具有直接与间接作用，虽未见PTEN直接活化RAD51启动子的报道，但PTEN的表达可增加E2F介导的反式活化或其它方式来活化RAD51表达[10-12]，从而来调节肿瘤细胞染色体的修复，显然对肿瘤的控制具有重要的生物学意义。
　　总之，本实验研究结果表明：PTEN通过影响多种细胞信号传导途径，可明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖，以野生型PTEN基因可反式诱导细胞质内NEDD4-1上调表达，另一方面PTEN入细胞核后诱导核内RAD51表达，表明外源性PTEN分子有利于通过上下游相关分子抑制细胞增殖，修复细胞内DNA双链断裂点(DSB)，维护基因组稳定。因此，核PTEN是必不可少的肿瘤抑制因子，由此可以推测维持细胞核内PTEN水平的稳定，对那些存在PTEN突变的肿瘤可能是一种治疗策略。显然，对于能选择性阻断PTEN多位点泛素化，而利于其单位点泛素化;有效阻止PTEN降解，且促进其进入细胞核内的药物，有可能成为治疗PTEN突变引起的肿瘤的新希望，进而为进一步的基因治疗卵巢癌研究奠定基础。至于调节PTEN稳定性、活性和位置的生理学信号是什么?PTEN的全部功能是否在任何方面对肿瘤抑制都是重要的?等问题也有待进一步研究。
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