骨碎补总黄酮治疗兔膝骨关节炎的实验研究

李贺1,王宸1,陈昌红2,段继强1 作者单位：1. 东南大学附属中大医院 骨科,江苏 南京 210009; 2. 江阴市中医院 骨科,江苏 江阴

　　【摘要】目的:探讨中药骨碎补总黄酮对兔膝前交叉韧带切断(ACLT)骨关节炎模型的作用机制。方法：新西兰大白兔30只,随机分为5组,即假手术组、ACLT 4周组、ACLT 8周组、骨碎补总黄酮4周组和骨碎补总黄酮8周组,每组6只。按照前交叉韧带切断法建立兔膝骨关节炎模型。于实验第4、8周处死动物,用ELISA法检测血清IL1β及PGE2水平,用硝酸还原酶法测定关节液中NO含量,并切取关节软骨,用RTPCR方法测定诱导型一氧化氮合酶(the inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达。结果：前交叉韧带切断各组IL1β、PGE2、NO及iNOS表达量较假手术组明显增高(P<0.05),并随着造模时间的延长,其表达量持续增加(P<0.05)。骨碎补总黄酮组较ACLT组表达明显降低(P<0.05)。结论：IL1β、PGE2、NO在骨关节炎的病理过程中起重要作用,并随着造模时间的延长,其表达量持续增加。中药骨碎补总黄酮对上述因子有抑制作用,并能下调关节软骨iNOS的表达,从而能够达到防治、治疗骨关节炎的作用。

　　【关键词】 骨关节炎; 骨碎补总黄酮; 细胞因子; 一氧化氮; 一氧化氮合酶; 兔

　　[Abstract] ob[x]jective: To investigate the effect of traditional Chinese medicine osteopractic total flavone(OTF) on rabbit anterior cruciate ligament transection (ACLT) model of osteoarthritis in rats. Methods: 30 New Zealand white rabbits were randomly divided into five groups of six rabbits each: Shamoperated group, ACLT 4week group, ACLT 8week group, OTF 4week group, OTF 8week group. In accordance with anterior cruciate ligament transection model of knee osteoarthritis was established in rabbits. At 4 and 8 weeks the experimental animals were killed, serum levels of IL1β and PGE2 were examined by ELISA, and NO content in synovial fluid was determined by nitrate reductase. Pieces of articular cartilage were cut, and the ex[x]pression of iNOS was measured by RTPCR. Results: The ex[x]pression levels of IL1β, PGE2, NO and iNOS in anterior cruciate ligament transection groups were significantly higher compared with shamoperated group(P<0.05), and increased with modeling time(P<0.05). The ex[x]pressions in osteopractic total flavone groups were significantly lower than those in the ACLT groups(P<0.05). Conclusion: IL1β, PGE2, NO in the pathological process of osteoarthritis may play an important role. Chinese medicine osteopractic total flavonoids can inhibit the abovementioned factors and downregulate iNOS ex[x]pression in articular cartilage, which can help to achieve the goal of prevention and treatment of osteoarthritis.

　　[Key words] osteoarthritis; osteopractic total flavone; cytokines; NO; iNOS; rabbits

　　骨关节炎是一种常见的关节病变,以中老年居多。虽然骨关节炎的发病率和流行病学的文献记载有限,但全世界的研究表明,60岁以上的人群中约9.6%的男性和18%的女性有骨关节炎的症状[1]。因此,骨关节炎又被称为“下半生疾病”。西药长期使用不仅副作用大,而且费用较高;传统中药在这方面有其独特疗效和优势。其中骨碎补作为常用中药之一,小,在较多组方中均被选用并取得了较好疗效。本项目拟通过单用骨碎补总黄酮对骨关节炎动物模型的干预及治疗,探讨骨碎补对骨关节炎作用的机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　健康新西兰大白兔30只,雌雄不限,体质量2.0～2.5 kg,由江苏省农业科学研究院畜牧场兔所提供。

　　1.2 主要试剂及药品

　　骨碎补总黄酮(商品名：强骨胶囊,国药准字：Z20030007),规格：每粒装0.25 g,12粒·盒-1,由北京岐黄制药有限公司提供;ELISA法检测IL1β、前列腺素E2(PGE2)试剂盒由R&D公司提供;NO试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;Trizol reagent、RTPCR试剂盒购于日本TaKaRa公司。

　　1.3 实验分组

　　健康新西兰大白兔30只,按随机原则分为5组,即假手术组、前交叉韧带切断法(anterior cruciate ligament transected,ACLT)4周组、ACLT 8周组、骨碎补总黄酮4周组、骨碎补总黄酮8周组,每组6只。

　　1.4 动物模型制备

　　采用前交叉韧带切断法造模[2]。2%戊巴比妥钠以30 mg·kg-1耳缘静脉注射麻醉。右膝部用脱毛剂去毛, 然后用0.5%的碘伏消毒。在膝内侧做2 cm纵形切口,依次切开皮肤、皮下组织及筋膜,打开关节囊,将髌骨向外侧脱位,暴露前交叉韧带。切断前交叉韧带,并切除断端1～2 mm,防止术后粘连。冲洗关节腔后依次缝合伤口,无菌敷料包扎。术后3 d肌肉注射青霉素,40万U·d-1。分笼饲养,术后注意观察兔的饮食等情况。假手术组仅做皮肤切口,不切断前交叉韧带。定期驱赶兔子,30 min·次-1。

　　1.5 给药

　　骨碎补总黄酮组术后按照人兔体表面积换算公式计算用量,制作成小胶囊,每日定时喂服。

　　1.6 取材

　　在术后第4、8周于耳缘静脉取血,在4 ℃条件下以3 000 r·min-1离心5 min,提取血清。耳缘静脉空气栓塞处死动物,在无菌条件下暴露右膝关节,向关节腔内注射1 ml生理盐水,用注射器混匀后抽取关节液。切取右膝关节股骨髁及胫骨平台关节软骨。标本置于-80 ℃冰箱保存备用。

　　1.7 检测

　　血清IL1β、PGE2的测定参照ELISA试剂盒使用说明书,以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数。关节液NO的测定采用硝酸还原酶法,按试剂盒说明操作。

　　iNOS(片段大小为262 bp)：正义链5′CGCCCTTC

　　CGCAGTTCT3′,反义链5′TCCAGGAGGACATGCAGC

　　AC3′;GAPDH(片段大小为118 bp):正义链5′ATGT

　　TTGTGATGGGCGTGAA3′,反义链：5′CGAAGTGGTC

　　GTGGATGA3′。RTPCR反应：每50～100 mg软骨组织中加入1 ml Trizol提取RNA,总步骤参照TaKaRa试剂盒。反应条件：95 ℃变性45 s,65 ℃(iNOS)或60 ℃(GAPDH)退火45 s,72 ℃延伸45 s。iNOS行35个循环,GAPDH行30个循环。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。紫外透射仪下观察扩增产物特异条带。

　　1.8 统计学处理

　　使用SPSS 17.0统计分析软件进行统计分析,数据以x±s表示。计量数据资料采用方差分析,样本均数间的两两比较用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 骨碎补总黄酮对兔血清IL1β、PGE2水平的影响 ACLT组血清中IL1β、PGE2表达水平较假手术组明显增高,而骨碎补总黄酮能显著降低血清中IL1β、PGE2的表达。见表1。表1 各组血清IL1β、PGE2水平的比较

　　2.2 骨碎补总黄酮对兔膝关节液NO水平的影响

　　假手术组、ACLT 4周组、ACLT 8周组、骨碎补总黄酮4周组和骨碎补总黄酮8周组NO的检测水平分别为(12.64±1.72)、(31.82±3.90)、(85.21±6.08)、(19.95±2.93)和(59.20±4.33)mmol·L-1。各组NO的表达均较假手术组增高P<0.05,并随着造模时间的延长ACLT 8周组NO表达水平显著高于ACLT 4周组(P<0.05),骨碎补总黄酮组NO表达水平则显著低于同期ACLT组(P<0.05)。

　　2.3 骨碎补总黄酮对兔膝关节软骨iNOS水平的影响 骨碎补总黄酮各组iNOS的mRNA的表达量(即与GAPDH的比值)与ACLT组有明显差异(P<0.05)，见图1。M. Marker; 1. 假手术组; 2. ACLT 4周组; 3. ACLT 8周组; 4. 骨碎补总黄酮4周组; 5. 骨碎补总黄酮8周组

　　3 讨 论

　　骨关节炎是以关节软骨退变、缺失,骨赘形成以及软骨下骨重塑为特点的,其病因尚未完全清楚,但其与系统复杂的生物、化学、机械以及酶反应通路等因素有关[3]。在关节组织由结构性破坏到出现疼痛、肿胀、功能障碍等临床症状的过程中,IL1β、PGE2等炎性介质起到重要作用。

　　IL1β在软骨细胞的降解、退变过程中起到重要的分解作用。IL1β有自我刺激效应,它可促进基质金属蛋白酶(MMPs)合成,并激活MMPs;另一方面它可抑制基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的合成,使胶原蛋白的降解增加,终导致关节软骨进行性破坏[3]。此外,IL1还能够刺激中性蛋白酶和前列腺素E的产生,加重关节的炎性反应,增加破骨细胞的活性,促进骨质吸收。

　　PGE2在骨关节炎的发生、发展过程中所起的作用目前仍存在争议[4]。炎症介质信号调节前体,如IL1或肿瘤坏死因子(TNFα)通过诱导表达环氧合酶(COX)和微粒体前列腺素合成酶1的生成来促进PGE2的合成,而合成的PGE2对IL1的表达有正反馈的促进作用,从而进一步诱导软骨细胞凋亡[5]。这说明PGE2在骨关节炎的病理过程中是存在促进作用的。

　　一氧化氮在人体中调理各种生理和病理生理过程。在骨关节炎的发生、发展过程中,诱导型iNOS表达上调,导致关节炎软骨产生了大量的一氧化氮和活性氧(ROS)[6]。一氧化氮同时抑制了蛋白多糖和胶原蛋白的合成,同时激活MMPs,介导细胞凋亡和软骨细胞炎症反应[7]。NO又可诱导产生COX2和PGE2,后者可诱导关节软骨的凋亡[8]。同时NO又可上调基质金属蛋白酶家族的表达,通过刺激兔关节软骨IL1的表达促进MMP1、2、3和9的mRNA转录增加,从而进一步促进骨关节炎的发生[9]。

　　从中医学角度分析,膝关节骨性关节炎属于“痹证”范畴。目前,对其病因病机基本上有两种看法：一是因虚致病,多因中老年肝肾虚衰,无以主骨养筋,风寒湿邪入侵而致气血瘀滞,久则骨质增大变硬。二是因病致虚,多由闪挫跌仆,气滞血瘀,久则肝肾亏损,脉络失和,渐成本病。现代药理研究发现,骨碎补对骨关节软骨有刺激细胞代偿性增生的作用,能改变软骨细胞功能,并能部分改善由于力学应力线改变造成的关节软骨的退行性变,降低骨关节病的发病率及发病程度,推迟发病时间。骨碎补药用部分为水龙骨科植物槲蕨或中华槲蕨的根茎,而骨碎补总黄酮是由其干燥根茎中提取的,是骨碎补主要有效成分。有研究表明骨碎补总黄酮具有较强的抗膝骨关节炎作用,实验显示骨碎补总黄酮减轻软骨病变,显著降低Mankin法软骨积分[10]。戈兵等[11]实验证实骨碎补总黄酮能够减轻兔膝骨性关节炎的软骨退行性变和滑膜炎症。赵晋宁等[12]进行骨碎补总黄酮的急性毒性实验研究,用相当于人体每日用药量的2 700倍的骨碎补总黄酮量给小鼠灌胃,连续观察7 d,小鼠均存活,饮食、活动、精神状态、皮毛肤色、大小便等均无异常变化,这证实骨碎补总黄酮未显示毒性作用,预期临床应用安全性良好。

　　本实验结果显示,ACLT模型组中兔血清中IL1β、PGE2以及关节液中NO,关节软骨中iNOS水平高于假手术组,且8周组较4周组高,差异有统计学意义。骨碎补总黄酮组各项指数明显低于ACLT模型组,说明中药骨碎补总黄酮可以抑制血清IL1β、PGE2的表达,并降低关节液中NO,关节软骨中iNOS的表达水平,从而能够达到防治、治疗兔膝骨关节炎的作用。本研究仅限于兔前交叉韧带切断模型,上述作用机制是否对人体有效尚有待研究。

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