TL1A抗体通过抑制活性氧产生阻止高糖诱导血管内皮细胞凋亡

作者：陈丰华,冯大明　　作者单位：南华大学心血管病研究所，动脉硬化学湖南省重点实验室

　　【摘要】 目的：探讨TL1A抗体在高糖所致活性氧(ROS)增多及细胞凋亡中的作用。方法：将培养的人脐静脉内皮细胞分为正常对照组、正常糖+TL1A组、高糖对照组、高糖+SOD+CAT组、高糖+TL1A抗体组和高渗对照组。采用流式细胞术检测人脐静脉内皮细胞ROS生成量; Annexin V/PI荧光双染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：与正常对照组相比，高糖对照组ROS生成量增加53%，细胞凋亡率达正常的5.8倍(P<0.01)。于正常糖培养液中加入外源性TL1A蛋白，活性氧的生成量及细胞凋亡率均明显增多，显著高于正常对照组和高糖对照组(P<0.01);在高糖培养液中加入9 μg/ml TL1A抗体，活性氧生成量由(71.63±6.61)降至(50.63±4.05)，细胞凋亡率由(23.70±3.20)% 降至(5.07±0.47)%(P<0.01)。结论：TL1A抗体通过抑制ROS产生阻止高糖诱导血管内皮细胞凋亡。

　　【关键词】 糖尿病,高糖,肿瘤坏死因子样配体1A抗体,活性氧;内皮细胞;凋亡

　　Abstract：ob[x]jectiveTo investigate the role of anti-TL1A-Ab in the prevention of high glucose-induced ROS generation and apoptosis in human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).MethodHUVEC were divided into six groups：normal control group，5.6 mM glucose plus TL1A group，high glucose control group，high glucose plus SOD plus CAT group，high glucose plus anti-TL1A-Ab group and high osmotic control group.ROS generation was determined by flow cytometry，apoptosis rate of HUVEC was determined by flow cytometry with Annexin V/PI double staining.ResultsExposure of HUVEC to 22.4 mM glocose for 24 h resulted in a significant increase in ROS generation and apoptosis，compared with normal control group(P<0.01).HUVEC ROS formation and apoptosis rate significantly increased after adding exogenous TL1A to media containing 5.6 mM of glucose for 24 h，compared with normal control group and high glucose control group(P<0.01).However，high glucose-induced HUVEC ROS generation and apoptosis was significantly attenuated by 9 μg/ml anti-TL1A-Ab 〔(50.63±4.05) vs (71.63±6.61)，(5.07±0.47)% vs (23.70±3.20)%,P<0.01〕.ConclusionAnti-TL1A-Ab preventets high glucose-induced HUVEC apoptosis through ROS inhibition.

　　Key Words:Diabetes;High glucose;Anti-TNF-like ligand 1 aberrance antibody;Reactive oxygen species;Endothelia cells;Apoptosis

　　糖尿病是当今严重危害人类健康的常见病，血管病变是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)主要并发症之一，其形成的确切机理尚不明了。血管内皮细胞受损被认为是血管病变的首要步骤，体外及在体研究都证明，高糖可抑制内皮细胞生长，延长细胞周期，诱导内皮细胞凋亡。内皮细胞凋亡是内皮受损的一种常见形式，阻止高糖触发的细胞凋亡，可能是DM血管并发症的有效防治途径。高糖诱导内皮细胞凋亡的机制尚未阐明。普遍认为，高糖诱导内皮细胞凋亡与活性氧(Reactive oxygen species，ROS)生成过量、清除减少，导致氧化应激(Oxidative stress)有关[1]。TL1A作为一种新近发现的能诱导血管内皮细胞凋亡的细胞因子，是否参与了DM血管病变的发生发展，目前国内外未见相关报道。我们近的工作得出在高糖条件下，TL1A表达明显增多。TL1A是否通过ROS诱导细胞凋亡尚未见报道。本文探讨TL1A抗体在高糖所致血管内皮细胞ROS增多及凋亡中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料和主要试剂：人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12细胞，中南大学湘雅医学院细胞中心提供)，TL1A蛋白和抗TL1A抗体(Biolegend公司)，Annexin V FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，活性氧检测试剂(北京 SINOPCR有限公司)。

　　1.2 实验分组：实验分为正常对照组(5.6 mM葡萄糖)，正常糖+TL1A组(5.6 mM葡萄糖培养液中加入外源性TL1A蛋白50 ng/L处理24 h)，高糖对照组(22.4 mM葡萄糖)，高糖+SOD+CAT组(22.4 mM葡萄糖培养液中加入超氧化物歧化酶200 U/ml，过氧化氢酶100 U/ml)，高糖+TL1A抗体组(22.4 mM葡萄糖培养液中加入9 μg/ml TL1A抗体)，高渗对照组(5.6 mM葡萄糖+16.8 mM甘露醇)。

　　1.3 活性氧含量的测定：细胞收集后经0.25%胰酶消化、洗涤，重悬于PBS中,调整细胞数至4 ×105/ml。加入DCFH-DA (无水乙醇配制)1 μl，避光，37 ℃水浴30 min，流式细胞仪检测荧光强度(激发光488 nm，发射光波长525 nm) 。

　　1.4 细胞凋亡检测：采用Annexin V/PI荧光双染色，流式细胞术检测细胞凋亡百分率。用不含EDTA的胰酶消化收集1～5×105个细胞，Binding Buffer悬浮后加入5 μl Annexin V-FITC混匀，加入5 μl Propidium Iodide，混匀;室温、避光，反应5～15 min，1 h内进行流式细胞仪的观察和检测。激发光波长488 nm，发射光波长530 nm。Cell Quest软件自动获取104个细胞/样品，流式细胞仪定量分析，计算annexin V-FITC及PI双染阳性细胞百分含量。

　　2 结果

　　2.1 TL1A抗体对高糖条件下人脐静脉内皮细胞活性氧生成的影响：正常对照组人脐静脉内皮细胞活性氧生成量为(46.80±4.10)，高糖对照组细胞活性氧生成量显著增高，为(71.63±6.61)，差异有统计学意义(P<0.01)。在正常糖培养液中加入50 ng/ml TL1A蛋白，人脐静脉内皮细胞活性氧生成量升高至(93.75±9.12)，达正常对照组的2倍，二者相比差异具有统计学意义(P<0.01)，也显著高于高糖对照组(P<0.01)。高糖培养人脐静脉内皮细胞上清液加入9 μg/ml TL1A抗体，活性氧的生成量由(71.63±6.61)降至(50.63±4.05)，差异具有统计学意义(P<0.01)，与高糖培养液中加入SOD和CAT组(53.32±5.41)相比略低，而与正常对照组相比有轻微增多，但差异均无统计学意义。

　　2.2 TL1A抗体对高糖所致人脐静脉内皮细胞凋亡的影响。正常对照组人脐静脉内皮细胞凋亡率为(4.09±0.39)%，高糖对照组人脐静脉内皮细胞凋亡率为(23.70±3.20)%，约为正常对照组的5.8倍，二者相比差异有统计学意义(P<0.01)。于高糖培养液中加入SOD和CAT，细胞凋亡率显著降低，为(5.41±0.55)%，与高糖对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01);而于高糖培养液中加入TL1A抗体，细胞凋亡率降至(5.07±0.47)%，显著低于高糖对照组(P<0.01)，略低于高糖+SOD+CAT组，与正常对照组相比无明显差异。正常糖培养液中加入TL1A蛋白，则细胞凋亡率达正常对照组8.6倍，达高糖对照组1.5倍(P<0.01)，高渗透压不引起细胞凋亡。

　　3 讨论

　　糖尿病血管病变是心、脑血管疾病的重要危险因素，也是人类致死、致残的重要原因，血管病变形成的机制尚不清楚。血管内皮细胞受损是血管病变的首要步骤，有研究表明，高血糖能诱导血管内皮细胞凋亡，其机制尚未阐明。氧化应激被认为是高血糖导致内皮细胞凋亡的核心机制。在我们的实验中，高糖使人脐静脉内皮细胞ROS生成增加53%，而在正常糖培养的HUVEC中加入TL1A，ROS的生成量增加1倍，为(93.75±9.12)，不仅显著高于正常对照组，也显著高于高糖对照组的(71.63±6.61)。在高糖培养的HUVEC中加入TL1A抗体，活性氧的生成量显著减少，为(50.63±4.05)，明显低于高糖对照组的(71.63±6.61)，P<0.01，也略低于高糖加ROS清除系统组，与正常对照组相比，无统计学差异，说明TL1A抗体能显著抑制高糖所致血管内皮细胞活性氧生成增多。

　　TL1A抗体抑制ROS生成的机制尚不清楚。氧化还原反应是细胞基本的生物化学反应，是细胞功能活动的基础，也是容易遭受损伤的环节。各种病理因素都有可能破坏细胞氧化还原的动态平衡，导致ROS生成增多，清除减少。高糖条件下，血管内皮细胞活性氧生成过多，主要来源被认为是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶和线粒体[2]。ROS增多引起氧化应激，导致多元醇通路激活、糖基化终末产物(AGEs)形成、蛋白激酶C(PKC)途径及氨基己糖途径活化，而上述通路的激活及AGEs 形成又可进一步激活NADPH氧化酶，促进更多的ROS形成[3]。 TL1A抗体是否通过抑制NADPH氧化酶和作用于线粒体减少ROS生成，有待阐明。

　　TL1A是新近发现的调节血管内皮细胞数量的负调控因子，其基本作用是诱导血管内皮细胞凋亡。在我们的试验中，高糖使人脐静脉内皮细胞凋亡显著增多，其细胞凋亡百分率约为正常对照组的5.8倍，于正常糖培养液中加入外源性TL1A，细胞凋亡率达正常对照组的8.6倍，达高糖组的1.5倍。在高糖培养液中加入9 μg/ml TL1A抗体，人脐静脉内皮细胞凋亡率由(23.70±3.20)% 降至(5.07±0.47)%(P<0.01)，与高糖+SOD+CAT组相比略低，与正常对照组相比有轻微增高，但二者相比差异均无统计学意义。结合前述结果，说明TL1A抗体能通过抑制活性氧生成而阻止高糖诱导血管内皮细胞凋亡。

　　TL1A抗体抑制ROS生成增多导致细胞凋亡，国外极少资料报道，国内未见报道。ROS可激活细胞内多种蛋白质和酶，导致核转录因子如NF-kB和激活蛋白-1(AP-1)表达上调，这些转录因子调节着编码多种炎性介质的基因，从而导致与血管细胞生理及病理功能密切相关的众多基因的表达。进一步的分析研究认为，高糖诱导组织损伤的共同要素是三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3- phosphate，GAPDH)受抑制[4]。ROS造成细胞核DNA链断裂，DNA损伤片段特异性激活多聚-ADP-核糖-聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)，活化的PARP 修饰GAPDH，使GAPDH分子的ADP核糖多聚化，导致其活性被抑制[5]。ROS作为极其重要的细胞内信使，通过抑制GAPDH活性几乎可激活所有已知的与糖尿病微血管及大血管并发症发生发展有关的信号转导通道，包括PKC通路、多元醇通路、己糖胺通路以及AGEs形成等。PARP的活化和GAPDH活性受抑制，造成糖酵解和线粒体的呼吸速率减慢，电子传递受阻、ATP缺乏，内皮功能紊乱甚至凋亡，并终导致DM血管病变形成[6]。探索用TL1A抗体或具有相似作用的药物对DM血管病变进行早期干预，减少ROS形成，阻止内皮细胞凋亡，有可能预防或延缓DM血管病变发生发展，成为DM血管病变防治中的一个有效途径。

　　【参考文献】

　　[1] Nishikawa T，Edelstein D，Du XL，et al.Normalizing mito-chondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage[J].Nature，2000，404(6779)：7871.

　　[2] Guzik TJ，Mussa S，Gastaldi D，et al.Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus：role of NAD(P) H oxidase and endothelial nitric oxide synthase[J].Circulation，2002，105(14)：1656.

　　[3] Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J].Nature，2001，414(6865)：8131.

　　[4] Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications：a unifying mechanism[J].Diabetes，2005，54(6)：1615.

　　[5] Garcia Soriano F，Virag L，Jagtap P，et al.Diabetic endothelial dysfunction：the role of poly (ADP-ribose ) polymerase activation[J].Nat Med，2001，7(1):108.

　　[6] Pacher P，Liaudet L，Garcia Soriano FG，et al.The role of poly ( ADP-ribose ) polymerase- activation in the development of myocardial and endothelial dysfunction in diabetes[J]. Diabetes，2002，51(2)：514.