BacT/ALERT 3D结核分支杆菌快速培养系统在脊柱结核诊断中的应用

作者：刘斌,蒋磊,王自立　　作者单位：1.宁夏医科大学，银川 750004; 2.宁夏中卫市医院骨二科，中卫 751700;3.宁夏医科大学附属医院骨科，银川 750004

　　【摘要】 目的 分析BacT/ ALERT 3D法培养脊柱结核病灶标本的结果，探讨其在脊柱结核诊断中的价值。方法 对符合本实验要求的53例脊柱结核患者的43例进行手术治疗，术中收集结核肉芽肿、脓液及硬化骨作为标本，标本预处理后分别接种于三个BacT/ ALERT 3D液体培养基和三个罗氏培养基进行培养;另10例患者行CT引导下脓肿或病椎穿刺，标本用BacT/ ALERT 3D法培养，抗痨2周后术中取同样标本再用BacT/ALERT 3D法培养。阳性者萋—尼抗酸染色镜检后，接种PNB和TCH培养基进行菌种鉴定。结果 43例患者BacT/ ALERT 3D法培养阳性19例(人型结核杆菌为16例，牛型结核杆菌为3例)，罗氏培养法阳性11例，阳性率分别为44%、25%，差异有统计学意义(P<0.005);阳性结果平均报告时间分别为16d和30d。其余10例患者入院即行CT引导下脓肿或病椎穿刺后BacT/ALERT 3D法培养，结果9例阳性，均为人型结核杆菌，阳性率90%，化疗2周后术中取同样标本经BacT/ ALERT 3D法培养仅2例阳性，阳性率20%，化疗前后结核分枝杆菌BacT/ ALERT 3D法培养阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。BacT/ ALERT 3D法培养标本阳性率在结核肉芽肿(44%)、脓液(23%)和硬化骨(9%)差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BacT/ ALERT 3D法是临床脊柱结核病原菌分离培养的较好方法,培养阳性率与培养物的取材时间、标本种类有直接关系。

　　【关键词】 BacT/ ALERT 3D法;脊柱结核;结核分支杆菌

　　Rapid Culture System of Mycobacterium Tuberculosis in the Diagnlsis of Spinal Tuberculosis　(Orthopaedics Dept.of the Affiliated Hospital of Ningxia Med.Univ.,Yinchuan 750004)

　　Abstract: ob[x]jective To analyze the results of BacT/ALERT 3D method in different obtain example time、in the culture of mycobacterium tuberculosis with various focuses and to study its applicability in the diagnlsis of spinal tuberculosis.Methods In 53 cases with spinal tuberculosis, 43 patients proper for this experiment were given surgery treatment and spinal tuberculosis granuloma,pus,and sclerosis bones were collected as the specimens during the surgery.The specimens were processed and inoculated into three BacT/ALERT 3D liquid vials and three L-J vials for culturing.Remainder 10 patients be hospitaltailed instantly CT lead pus,or the bad major part of a vertebra centesis processed BacT/ALERT 3D liquid and chemotherapy two week obtained alike example processed BacT/ALERT 3D liquid.The positives were observed with microscope after using conventional anti-acid colouration,and inoculated into PNB or TCH vials to appraise the kind of the bacteria.Results With BacT/ALERT 3D method,19 of the total 43 specimens showed cultured positive 16 specimens were identified as M.tuberculosis infection and 3 as M.bovis with L-J method,11 showed cultured positive.The positive rate of the two culture methods was 44%,25%℅respectively，two culture methods showed significant difference.The average days of report was 16 days and 30 days respectively.10 patients be hospitaltailed instantly CT lead pus,or the bad major part of a vertebra centesis processed BacT/ALERT 3D liquid,positive rate was 90%，and chemotherapy two week obtain alike examples processed BacT/ALERT 3D liquid,positive rate was 20%.The differences of positive rate before and after chemotherapy showed statistical significance.The positive rate of the BacT/ALERT 3D method in the culture of spinal tuberculosis granuloma,pus or caseous tissue,and sclerosis bones was 44%,23%,9% respectively and showed statistical significance Among them.Conclusion BacT/ALERT 3D method is a good means for the clinic separation and culture of the spinal tuberculosis pathogeny bacteria.

　　Key words:BacT/ALERT 3D method; spinal tuberculosis; mycobacterium tuberculosis

　　结核分支杆菌的细菌学检查是结核病明确诊断和提供有效化疗方案的重要依据，是考核和评价临床疗效的可靠标准。但在脊柱结核的诊治中由于常规检查方法检出率低，使得脊柱结核细菌学检查受到忽视，其病原学及其耐药性的研究报道不多，随着AIDS的流行，非结核分枝杆菌所致结核病发病率增高[1-2]，脊柱结核病的细菌学检查显得尤为必要。本研究用BacT/ ALERT 3D法培养同一脊柱结核患者不同病灶的标本，观察不同标本的阳性检出率有无差异，并与传统的罗氏培养法进行比较，以分析BacT/ ALERT 3D结核分支杆菌快速培养系统在脊柱结核诊断中的临床应用价值，更好的指导临床工作。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　2009年1月—10月在我科住院并接受手术治疗的脊柱结核患者53例，其中男25例，女28例，年龄18～62岁，平均37岁。43例患者影像学检查有脓肿、空洞型硬化骨形成，术中可见结核肉芽肿，并且术前临床表现、实验室检查、术后病理学报告均符合脊柱结核特点;术前四联抗痨2～6周，待血沉和C反应蛋白分别降至40mm•h-1和8.6μg后手术;术中每例患者分别取结核肉芽肿、脓液15～20mL、病椎中心的死骨(硬化骨)用咬骨钳咬成少1cm×1cm×1cm大小，无菌操作下用标本带密封。8h内将标本前处理后分别接种于3个BacT/ ALERT 3D液体培养基和3个罗氏培养基。另10例患者入院即行CT引导下脓肿或病椎穿刺后BacT/ ALERT 3D法培养，抗痨至少2周后再术中取同样标本用BacT/ ALERT 3D法培养。

　　1.2 标本前处理

　　所有标本加入N—L—C溶液，在旋转搅拌器上震动1min，室温静置15min加入无菌的pH6.8磷酸盐缓冲液5mL，4500r•min-1离心15min，调pH在7.0左右，弃上清后取0.5mL的混悬液接种。

　　1.3 实验方法

　　罗氏培养法：按1995年中国防痨协会公布的“结核病诊断细菌学检验规程”进行[3];BacT/ ALERT 3D法：用油酸、甘油、紫色染料和浓度为1%的牛血清蛋白组成的10mL复溶液溶解一瓶含有二性霉素B、阿洛西林、多黏菌素等组成的抗生素添加剂，在接种标本前加0.5mL的抗生素添加剂至BacT/ ALERT 3D MP 处理培养瓶中，然后每瓶接种经中和或离心沉淀后的标本0.5mL接种，培养瓶经扫描确认后，放入BacT/ALERT 3D 全自动分枝杆菌培养仪中，由仪器自动监测，仪器提示阳性后取出，阴性在42d后仪器报告阴性后取出。

　　1.4 萋—尼抗酸染色镜检及常规菌种鉴定

　　所有培养阳性者行抗酸染色镜检及参照《结核病诊断细菌学检验规程》分枝杆菌菌种鉴定方法[3]，接种PNB和TCH培养基进行菌种鉴定。

　　2 结果

　　2.1 两种培养方法的比较

　　43例患者BacT/ ALERT 3D法培养阳性25例，其中6例镜检后发现为杂菌污染，包括2例肉芽肿标本，4例硬化骨标本，故实际培养阳性结果为19例;罗氏培养法共培养阳性11例，无1例标本出现杂菌污染。BacT/ ALERT 3D法培养阳性率为44%，高于罗氏培养法的25%(P<0.05)，BacT/ ALERT 3D法总的阳性平均报告时间为16d，快12h，罗氏培养法平均为30d，快出现阳性所需时间为25d，阳性结果菌种鉴定后人型结核杆菌为16例，牛型结核杆菌为3例。

　　2.2 化疗前后结核分枝杆菌BacT/ ALERT 3D法培养的阳性结果比较

　　10例患者入院即行CT引导下脓肿或病椎穿刺后BacT/ ALERT 3D法培养，阳性9例，化疗2周后术中取同样标本经BacT/ ALERT 3D法培养仅2例出现阳性，化疗前后结核分枝杆菌BacT/ ALERT 3D法培养阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3 BacT/ ALERT 3D法培养同一患者不同病灶标本的阳性结果比较

　　BacT/ ALERT 3D法培养43例患者结核肉芽肿标本阳性19例，脓液标本阳性10例，硬化骨标本阳性仅4例，阳性率分别为结核肉芽肿(44%)、脓液(23%)和硬化骨(9%)，三者差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨论

　　3.1 培养方法的选择

　　脊柱结核是常见的肺外结核，占全身骨关节结核的50%以上，如能早期诊断及治疗，可避免畸形和瘫痪的发生。目前我国脊柱结核的诊断大多依靠患者的病史、临床表现、影像学表现及术后组织学检查来确诊，但时常存在难以与非典型性脊柱结核、化脓性脊柱炎等疾病相鉴别的困惑。细菌培养是诊断结核分枝杆菌疾病的金标准，但传统的罗氏培养法培养结核分枝杆菌至少2～8周甚至更长的时间才能出现阳性结果[4]，同时由于脊柱结核的诊治中脊柱结核在结核病的流行传播中重要性较小，培养阳性率低，再加上术前患者至少需要2周以上的抗痨，使活菌数量进一步减少，有关文献报道其培养阳性率分别为30.2%和14.5%[5-6]，较长的等待时间和低的阳性率使大多数临床医生不愿进行结核分枝杆菌培养。

　　BacT/ ALERT 3D 系统是利用细菌在生长过程中产生CO2的原理，通过比色计传感器和反射光连续自动监测培养瓶底部的CO2变色指示剂的颜色变化来显示培养瓶内是否有细菌生长。本研究BacT/ ALERT 3D法培养阳性率为44%，明显高于罗氏培养法的25%;阳性出现所需时间BacT/ ALERT 3D法短于罗氏培养法，高阳性率和短培养时间可能与以下三方面有关：(1)所送标本均前处理后离心取沉淀接种，提高了阳性检出率;(2)具有严密封闭性的专用培养基中有足够的营养成分供结核菌生长的需要;(3)结核杆菌佳恒定的生长条件如温度、湿度等远比罗氏培养法优越。

　　BacT/ ALERT 3D 系统在结核分支杆菌快速培养中有操作简便、全自动化、高阳性率及耗时短等优点[7-8]，对脊柱结核的早期诊断有较高的临床意义，但BacT/ ALERT 3D 系统价格昂贵，液体培养基依赖进口，从而限制了在临床的推广和应用[9]，如能自行研制和改进培养基、降低成本、则可在更多医院推广。

　　3.2 培养物取材的时间及培养物的选择

　　脊柱结核如能早诊断、早治疗，不仅可抑制病变发展、缩短疗程，减轻患者经济负担,避免或减少畸形发生,且可以保全功能,甚至可以不用手术而达到治愈的目的，但由于培养取材较困难，目前大部分研究者培养的标本是在术中取得，术前至少已抗痨2周以上。抗痨药物的使用,使得病灶中的菌量减少，活性降低，结核菌培养的阳性率较低。另有研究表明[10]有些麻醉药也能抑制试管内结核分枝杆菌的生长。国内有学者[11]认为化疗2个月内与化疗2个月后采集的标本其培养阳性率差异有统计学意义。本研究有10例患者入院即在CT引导下脓肿或病椎穿刺后行BacT/ ALERT 3D法培养，化疗前后结核分枝杆菌用BacT/ ALERT 3D法培养阳性率的差异有统计学意义，说明抗痨药物的使用可使病灶中菌量减少，活性降低,尽早取材经BacT/ ALERT 3D法培养,可以提高培养的阳性率。

　　非典型性脊柱结核一般指影像学非典型性脊柱结核，其发生率为2.1%～12%[12]，如椎管内结核性肉芽肿，它是由原发病灶的结核病转移，或结核菌经血行或淋巴侵入脊柱，引起脊柱破坏和硬脊膜外冷脓肿结核性肉芽肿，与椎管内肿瘤、硬膜外肉芽肿、硬膜下肉芽肿等疾病鉴别较难;这些疾病术后病理报告有时难以排除结核又易造成误诊。在本研究中结核肉芽肿阳性率为44%，显著高于脓液的23%和死骨的9%，结核肉芽肿未培养出阳性结果的，脓液和死骨均未培养出，说明结核肉芽肿活菌数量较多，对临床非典型脊椎结核的明确诊断具有较高的临床价值，在临床标本培养中应。本研究中脓液培养有10例阳性结果，阳性率为23%，虽低于结核肉芽肿的44%，但高于死骨的9%，所以没有结核肉芽肿情况下应选用脓液培养。脓液培养没有1例出现杂菌污染，与脓液易接种有关，这可能是大部分研究者喜欢脓液培养的原因。4例硬化骨阳性结果，阳性率9%，说明死骨中含有活菌，所以术中应采取正确的方法将硬化骨“清除”。但由于硬化骨硬度较高需要用咬骨钳咬成少1cm×1cm×1cm才能接种，增加了杂菌的污染率，培养中尽量不要用硬化骨。

　　【参考文献】

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