紫花茄皂苷I5对不同肿瘤细胞系的体外抗肿瘤作用

作者：曹同涛
　　【摘要】 目的 探讨紫花茄皂苷I5对不同肿瘤细胞系的体外抗肿瘤作用。方法 用酸性磷酸酶(APA)法检测紫花茄皂苷I5对不同部位人源性肿瘤细胞株体外生长的抑制作用。结果 紫花茄皂苷I5对所试肿瘤细胞株的体外生长皆具有一定的抑制作用，尤其是对人肝癌BEL7404、人鼻咽癌CNE和人结肠癌HT29细胞的生长抑制作用较强，抑制率可达到70%以上。结论 体外实验表明紫花茄皂苷I5对4种不同部位人源性肿瘤细胞株皆具有一定的抗肿瘤细胞生长作用，敏感细胞株为肝癌和结肠癌细胞。
　　【关键词】 皂苷 酸性磷酸酶法(APA) 抗肿瘤作用
　　【Abstract】 ob[x]jective To examine the inhibitory effects of saponin I5 in Solanum indicum L. on different tumor cell lines in vitro.Methods Acid phosphatase assay (APA) was adopted to detect the effects of saponin I5 on the growth of tumor cell lines in vitro.Results The solanum saponin had inhibitory effects on every tested tumor cell line.Especially, the growth inhibitory ratio of saponin I5 on the tested tumor cell lines(BEL7404, CNE and HT29)reached above 70%.Conclusion The solanum saponin I5 has inhibitory effects on the growth of tumor cell lines in vitro，and the most sensitive cell line to saponin I5 is hepatocarcinoma cell.

　　【Key words】 saponin, acid phosphatase assay(APA), antitumor effect

　　近年来随着分离提取技术的不断发展，多种薯蓣皂苷被分离出来，并不断发现其新的生物活性，特别是在抗肿瘤、免疫调节、抗炎、降血脂、抗艾滋病等方面的作用引起了人们的重视[1，2]，我们的前期研究结果已显示合成紫花茄皂苷具有一定的抗肿瘤作用，对人源肝癌BEL7402细胞株的生长具有抑制作用，还可诱导BEL7402细胞的凋亡[3，4]。为了更好的认识紫花茄皂苷I5的抗肿瘤谱，本研究采用4种不同部位人源性肿瘤细胞株对紫花茄皂苷I5进行体外抗肿瘤筛查，探讨其体外抗肿瘤作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料

　　1.1.1 主要试剂及仪器 RPMI1640培养基购自Gibco BRL公司，DHanks液、PBS缓冲液、0.1%EDTA溶液等均按常规配制[5,6]，新生牛血清为黑龙江省同江市江海生物公司产品，二氧化碳培养箱(Hereus公司)，96孔细胞培养板为Nunc公司产品，EL311酶标免疫检测仪(BioTek公司)，相差倒置显微镜(Olympus)。
　　1.1.2 细胞株 人肝癌BEL7404细胞系，引自北京大学医学部细胞生物学系。人鼻咽癌CNE细胞系、人结肠癌HT29细胞系、人大细胞肺癌NCIH460细胞系均购自中国科学院上海细胞资源中心。
　　1.2 方法

　　1.2.1 药物及配制：紫花茄皂苷I5由中国科学院生态研究环境中心生物技术室提供。皂苷以二甲基亚砜(DMSO)溶解，加入细胞前用培养液稀释至1～10 g/ml，其中DMSO高浓度为0.1%。阴性对照为0.1%DMSO的培养液。
　　1.2.2 酸性磷酸酶法(acid phosphatase assay, APA)[7]体外抗肿瘤谱筛选：取对数生长期细胞，消化后制成细胞悬液，按1×103/孔的密度接种于96孔板。培养24 h后，实验组加入先用DMSO溶解、再经RPMI1640培养液稀释至终浓度为1～10 μg/ml的皂苷;空白对照组加入RPMI1640培养液;溶剂对照组加入经同样稀释的溶剂，含0.01%～0.1%DMSO。实验中每个浓度设8个平行孔，作用72 h后用APA法经EL311酶联免疫检测仪在405 nm波长处测定吸光度OD值，空白孔调零，实验重复三次，取平均值。按下列公式计算细胞生长抑制率：生长抑制率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×。
　　1.3 统计学方法 实验中每组设平行孔8个，结果用平均值表示。使用SPSS 10.0统计分析软件包分析统计学差异，方法采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)，P<0.05为差异具有显著性。
　　2 结果

　　2.1 紫花茄皂苷I5作用后对肿瘤细胞形态的影响 4种不同部位人源性肿瘤细胞生长72 h后，光镜下观察，未给药组细胞贴壁并呈梭形或多边形生长，细胞数目多，铺满整个瓶底，细胞生长状态较好。皂苷I5高剂量组细胞贴壁状况不好，折光性较差，部分细胞漂浮在培养液中，活细胞数目较对照组少。
　　2.2 紫花茄皂苷I5体外细胞抗肿瘤谱筛选 APA法原理是利用活细胞内的酸性磷酸酶在酸性环境下分解磷酸酶底物硝基苯磷酸盐，形成淡黄色的产物，用酶标仪在405 nm处检测吸光度。该方法可用于96孔板培养的各种细胞，十分简便快捷，灵敏度高(可达100个细胞/孔)、重复性好[7]。
　　各肿瘤细胞株经体外APA法检测筛选，紫花茄皂苷I5对肿瘤细胞生长的抑制率见表1。实验结果表明，紫花茄皂苷I5敏感细胞系为人肝癌细胞株BEL7404、人鼻咽癌细胞株CNE和人结肠癌HT29细胞，其大抑制率皆达到70%以上，而对人大细胞肺癌NCIH460细胞的有效浓度从6 μg/ml开始，大抑制率仅为50%左右。表1 紫花茄皂苷I5对不同肿瘤细胞系的增殖抑制率 注：与空白对照相比, *P<0.05,△P<0.001

　　3 讨论

　　大量研究结果表明，植物来源的抗肿瘤药具有种类多、小、不良反应少的特点。因此，从植物中寻找高效的抗肿瘤药物已成为一种新的研究思路[8]。近年来国内外学者也对皂苷类药物的抗肿瘤作用及其作用机制进行了研究。Chiang等[9]证实从紫花茄中提取的薯蓣皂苷、甲基原皂苷、甲基原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷对结肠癌Colo205、鼻咽癌KB、宫颈癌Hela肿瘤细胞株有杀伤作用。马朋等[3]报道，合成紫花茄皂苷在体外可诱导肝癌细胞BEL7402凋亡。
　　本研究采用多种不同部位的人源性肿瘤细胞株对紫花茄皂苷I5的体外抗肿瘤作用进行系统观察，探讨其抗肿瘤作用及其可能的敏感肿瘤细胞株。筛选实验发现紫花茄皂苷I5对所选用的肝癌细胞株BEL7404和结肠癌细胞株HT29生长抑制作用较强，其大抑制率皆达到90%以上;对人鼻咽癌细胞株CNE敏感性其次，大抑制率为70%以上;而对NCIH460细胞的敏感性差，有效浓度从6 μg/ml开始，大抑制率仅为50%左右，从而提示对紫花茄皂苷I5较敏感的细胞株是肝癌细胞和结肠癌细胞。由于肝癌是国内发病率较高的一类肿瘤，结肠癌是发达国家发病率较高的一类肿瘤，我国的发病率也日趋升高，深入研究紫花茄皂苷的抗肿瘤作用，对医药事业的发展具有实用价值。有关紫花茄皂苷体内药效的验证将有待于进一步的研究。
　　【参考文献】
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　　[3] 马朋, 顾国峰, 陈希, 等.合成紫花茄皂苷诱导人肝癌BEL7402细胞凋亡[J].中国肿瘤临床, 2005, 32(9): 481485.

　　[4] 马朋, 曹同涛, 顾国峰, 等.合成紫花茄皂甙诱导人肝癌细胞株Bel7402凋亡的作用机制[J]. 癌症, 2006,25(4):438442.

　　[5] 薛庆善. 体外培养的原理和技术[M].北京：科学出版社,2001：53.

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　　[8] 王佩,李玉珍,齐有利.植物类抗肿瘤药成为市场主导[J].首都医药,2003,10(5):3334.

　　[9] Chiang HC, Tseng TH, Wang CJ. Experimental antitumor agents from Solanum indicum L. [J].Anticancer Res, 1991, 11(5):19111917.