乙型肝炎病毒X基因对肝癌细胞Bel7404细胞周期的影响

　　作者：林松挺1,陈正义1,陈莹晖2,程斌　　作者单位：海南医学院科研基金资助学报项目(0020100315)(1 中南大学湘雅医学院附属海口医院消化内科，海南 海口 570208;2 海南医学院附属医学中心ICU，海南 海口 570102;3 华中科技大学同济医学院附属同济医院，

　　【摘要】目的：构建转基因细胞株Bel7404/HBx,研究HBx对肝癌细胞周期及凋亡的影响，为探索HBx与原发性肝细胞癌(HCC)之间的关系提供更为完善的理论依据。方法：运用脂质体转染及G418筛选获取Bel7404/HBx阳性克隆，并分别用聚合酶链反应(RTPCR)和Westernblot鉴定HBx mRNA与蛋白的表达，进一步用四唑兰比色实验(MTT)检测Bel7404/HBx的增殖，流式细胞仪(FCM)检测Bel7404/HBx的细胞周期及凋亡。结果：成功构建Bel7404/HBx，MTT检测结果表明Bel7404 /HBx生长速度加快，流式细胞仪检测结果显示,与对照组细胞相比, Bel7404 /HBx凋亡率明显降低(P<0.05)，G1期细胞比例降低(P<0.05), S期及G2期细胞所占比例增高(P<0.05)。结论:HBx能加速细胞周期进程，从而促进肝癌细胞的生长并抑制细胞凋亡，可能对肝癌细胞恶性程度具有重要的影响。

　　【关键词】 HBx,原发性肝细胞癌,聚合酶链反应;免疫印迹;四唑兰比色实验;流式细胞术

　　ABSTRACT] ob[x]jective: To establish transgenic cell lines Bel7404/HBx, study the influence of HBx on cell cycles and apoptosis, and provide more extensive theories for exploring the relationship between HBx and hepatocellular carcinoma (HCC). Methods: The Bel7404/HBx positive clones were obtained by Lipofectamine tranfection and G418 selection, then HBx mRNA and protein were detected by reverse transc[x]ription polymerase chain reaction(RTPCR) and Western blot, respectively. The tetrazolium blue colorimetric test (MTT) and flow cytometer ( FCM) were used to measure proliferation, cell cycles and apoptosis of Bel 7404/HBx. Results: Bel7404/HBx was successfully established. MTT showed that the Bel7404 / HBx grew faster than the control group (P<0.05), and FCM showed that compared with cells in control group, the apotosis rates of Bel7404/HBx were at a low level, cells in G1 phase decreased but increased in S and G2 phase in proportion(P<0.05). Conclusions: HBx can accelerate cell cycle progression to promote the growth of hepatoma cells but inhibit apoptosis, which indicates that it may have great influence on the malignant degree of hepatocellular carcinoma.

　　KEY WORDS] HBx; Hepatocellular carcinoma; RTPCR; Western blot; MTT; FCM

　　原发性肝细胞癌(HCC)一直以来是危害人民身心健康的一大疾病，其发病机理多种多样，其中HBV在其发病中一直占据重要的地位。目前研究证实，HBV中小的阅读框X基因在HCC发生中所起的作用至关重要，但各家研究结论不太一致，有的结论甚至互为矛盾，这也使得HBx致癌机理尚未研究清楚。因而，HBx致HCC机理仍然是目前研究的热点，为此，我们以重组质粒pcDNA3.1 (+) /v5hisBHBx作为载体，通过脂质体转染将X基因导入肝癌细胞Bel7404细胞系中，用G418筛选获取稳定表达HBx蛋白的阳性克隆，并观察HBx对肝癌细胞Bel7404增殖、凋亡及细胞周期的影响，为进一步探索HBx与HCC之间的关系提供更为完善的理论依据，希望能为肝细胞癌的预防、诊断及治疗提供新的策略。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　Effectene Transfection Reagent(Qiagen);G418(Promega);各种限制性核酸内切酶、聚合酶等(Takara);鼠单克隆抗体(ABCam);羊抗鼠IgG(晶美);DMEM 、MTT及PI(sigma)。重组质粒 pcDNA3.1(+)/v5hisBHBx由上海第二军医大学遗传研究所何晓文教授惠赠;DH5α由西班牙Navarra大学癌症基因研究所钱程教授提供;Bel7404细胞由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所刘新垣院士惠赠。扩增HBx基因片段上游引物为：5′ CGGAATTCCGATGGCTGCTAGGCTGTG3′,命名为P1,下游引物为：5′CCCTCGAGGGTGCATGGTGCTGGTGA3′,命名为P2，扩增目的片段为445bp,PCR引物合成及测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Bel7404细胞的转染与筛选 重组质粒 pcDNA3.1(+)/v5hisBHBx经酶切、PCR及测序鉴定后按Effectene Transfection Reagent说明书进行转染操作，48h后用含500mg/L G418的选择培养基筛选阳性克隆。筛选至对照组细胞全部死亡后实验组存活的细胞即为阳性克隆，挑取克隆扩大培养并将G418浓度减至250mg/L维持筛选，以获得稳定表达HBx的转基因细胞株(Bel7404/HBx)。实验设空白对照组(Bel7404细胞)与空载体对照组(转染pcDNA3.1的Bel7404细胞，Bel7404/ pcDNA3.1)。以下所设对照组与此相同。

　　1.2.2 转基因细胞株Bel7404/HBx的鉴定 采用聚合酶链反应(RTPCR)检测HBx mRNA的表达: TRIzol一步法提取各组细胞总RNA(按试剂盒说明书操作)，经逆转录生成cDNA，取2μL cDNA作模板，以上述引物扩增HBx基因片段，条件如下：94℃预变性10min，94℃变性45s，52℃退火1min，72℃延伸1min，扩增30个循环，2%琼脂糖凝胶电泳后成像观察。Western blot检测HBx 蛋白的表达:各组细胞培养48h后置冰上PBS洗涤2次，加入冰预冷的细胞裂解液100μL(按1∶100加入PMSF)充分裂解细胞，4℃ 13000g离心2min,上清即总蛋白，转上清至另一EP管中,加入适量2×SDS凝胶加样缓冲液(65mmol/L TrisHCl,pH：6.8;100mmol/L DTT;2%SDS;0.1%溴酚蓝;10%甘油),100℃加热5min使蛋白变性,4℃ 3600g离心2min,采用BCA试剂盒检测蛋白浓度(按说明书操作),取适量蛋白样品行SDSPAGE电泳，然后半干转印于NC膜上，封闭液室温封闭1h，加入鼠单克隆HBx抗体(一抗)，4℃孵育过夜，以TBST振摇洗涤3次，每次5min，加入羊抗鼠IgG(二抗)，室温孵育1h，接着以TBST振摇洗涤4次，每次5min，直接用Odyssey双色红外激光成像系统检测结果。

　　1.2.3 四唑兰比色实验(MTT)检测细胞的增殖及凋亡 各组细胞消化后配成单细胞悬液，以1×104细胞/孔接种于96孔板，共4板，各设4复孔,另设一PBS对照孔。培养24h后，取出1板每孔加MTT溶液(0.5g/L)100μL，置培养箱继续培养4h，吸弃孔内上清液，每孔加入150μL的DMSO，振摇15min溶解结晶，酶联免疫检测仪于595nm波长处分别测定各孔光吸收值(A值)，取其均数作为本次A值计数值。培养48、72、96h后再重复上述步骤检测，以时间为横轴，A值为纵轴绘制各组细胞生长曲线图。

　　1.2.4 流式细胞术检测各组细胞周期及凋亡情况 将各组细胞收获后，用PBS洗涤1次，-20℃ 75%乙醇固定过夜，取出离心收集细胞，PBS洗涤2次，加入10g/L Rnase37℃孵育15min,再加入碘化丙锭(PI)染色30min，300目尼龙网过滤，采用FAC SAricaTM流式细胞仪检测细胞周期及凋亡状况。各组细胞再加入诱导凋亡佳浓度的ADM培养48h后用上述相同方法处理，上机检测细胞凋亡及细胞周期的变化。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，流式细胞仪检测的凋亡率及细胞周期的比较采用χ2检验。MTT检测细胞增殖的比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Bel7404/HBx的筛选

　　采用G418浓度为500mg/L的选择培养基培养14d后,对照组细胞全部被杀死, 转染HBx基因的Bel7404细胞可见有阳性克隆的形成。

　　2.2 HBx基因表达检测结果

　　林松挺等.乙型肝炎病毒X基因对肝癌细胞Bel7404细胞周期的影响

　　RTPCR显示，实验组Bel7404/HBx及重组质粒pcDNA3.1/HBx可见HBx条带，而空白对照组Bel7404细胞与空载体对照组Bel7404/pcDNA3.1均未见HBx条带(图1)，表明Bel7404/HBx在转录水平上有HBx mRNA的表达;Western blot显示实验组可见HBx蛋白表达条带，而空白对照组与空载体对照组则未见HBx蛋白表达条带(图2)。表明稳定表达HBx的转基因细胞株Bel7404/HBx构建成功。

　　图1 RTPCR鉴定阳性克隆中HBx mRNA的表达

　　图2 Western blot鉴定阳性克隆中HBx蛋白的表达

　　2.3 细胞增殖情况

　　MTT法检测各组细胞A值发现，Bel7404与Bel7404/pcDNA3.1细胞生长速度基本一致(P>0.05)， 而Bel7404/HBx细胞在48、72、96h各时间点的A值均明显高于对照组Bel7404细胞和Bel7404/pcDNA3.1(P<0.05), 表明Bel7404/HBx细胞生长速度明显加快(图3)，显示HBx对Bel7404细胞具有促增殖作用。

　　图3 Bel7404 /HBx、Bel7404/pcDNA3.1和Bel7404细胞生长曲线

　　2.4 流式细胞仪检测凋亡及细胞周期

　　各组细胞培养48h经PI单染后用FACSAricaTM flow cytometer检测，重复实验3次，每次每组检测5×104个细胞，结果显示，与对照组相比，Bel7404/HBx凋亡率降低(P<0.05)，G1期细胞比例减少(P<0.05)，S期与G2期细胞比例相应增加(P<0.05),见表1。

　　表1 3组细胞的凋亡率及各细胞周期所占比例的比较 %(±s)

　　组别凋亡率

　　细胞周期

　　G1SG2

　　空白对照组(Bel7404)12.64±0.0262.38±0.0336.03±0.011.36±0.02

　　空载体对照组(Bel7404/pcDNA3.1)9.58±0.0163.46±0.0136.01±0.000.53±0.00

　　实验组(Bel7404/HBx)2.97±0.01*52.64±0.01* 41.08±0.01* 5.51±0.00*

　　注：与对照组相比，*P<0.05。

　　3 讨论

　　HCC是世界范围内恶性程度高的肿瘤之一，每年有超过50万人死亡，我国为肝癌高发区，病死率在各种肿瘤中占前列，占癌症死亡率第2位。虽然目前肝癌的研究已有长足的进步，但其预后仍然很差，因此，肝细胞癌是严重危害人民身心健康的恶性肿瘤之一，故深入研究HCC的分子机制对肝癌提供新的防治策略具有十分重要的意义。研究证实，HBV基因组共有4个开放阅读框：prec/c、p、pres/s与X基因[1，2]，其中X基因是小的一个开放阅读框，编码基因区位于 1374～1838核苷酸之间，编码产物为HBx蛋白,具有强大的生物学功能，包括反式激活病毒基因组和宿主细胞基因的转录、增强转录因子DNA结合特性、抑制P53蛋白活性、抑制细胞DNA的修复、参与细胞信号传导途径和细胞凋亡的调控等[3]，这些功能可能与原发性肝细胞癌的发生具有密切的关系[4-7]。研究证实，HBx在体内和体外均可诱导肝细胞的恶性转化及癌变[8，9]，这些为HBx引发原发性肝细胞癌提供了依据。但也有研究表明，单纯的HBx基因表达并不足于引起肝细胞癌，可能是细胞恶性转变的一个促进因素,也就是增加机体对致癌物质诱导肝癌的易感性[4，8]。由此可见，HBx致癌机制复杂，且目前的研究尚不能确定HBx在HCC中的确切作用[4，8]，许多研究结果仍存在很大争议，有的结果甚至相互矛盾，故HBx致癌机理一直是近年研究的热点。

　　到目前为止，为了研究 HBx的功能以及HBx致HCC的机理，已建立了多种 HBV X基因表达体系，但因受实验条件、细胞类型、培养环境以及HBV感染的阶段等因素的影响而导致HBx表达的差异，进而影响实验的结果，这也可能是目前研究结果存在争议的原因之一。因此，在一种细胞模型或动物模型实验研究中得出的结果并不一定能反映在人体的实际情况，必须用多种模型去验证及研究，为全方位、多方面揭示HBx致HCC机理提供更多的理论依据，尽可能发现先前互为矛盾的真谛所在，并采取有针对性的研究措施，为以后研究HCC的致病机理取得更进一步的突破。为此，本实验通过脂质体转染将HBx基因导入Bel7404细胞中，通过G418筛选获取阳性克隆，并进行RTPCR和Western blot检测HBx mRNA和HBx蛋白的表达情况，实验结果表明在转录水平和翻译水平均有HBx的表达，表明稳定表达HBx的转基因细胞模型Bel7404/HBx构建成功。在此基础上用MTT检测了Bel7404/HBx 、 Bel7404/pcDNA3.1和 Bel7404细胞的增殖情况，结果发现Bel7404/HBx的生长速度远远高于其它两组细胞，这些说明HBx具有促进细胞增殖的作用。进一步通过流式细胞仪分别检测Bel7404/HBx 、 Bel7404/pcDNA3.1和 Bel7404细胞周期特点和凋亡情况，结果显示，Bel7404/HBx细胞凋亡率较低，只有(2.97±0.01)%，而其它两组对照组细胞Bel7404/pcDNA3.1和Bel7404的凋亡率较高，分别达到(9.58±0.01)%和(12.64±0.02)%，具有显著性差异(P<0.05)，细胞周期中Bel7404/HBx在G1期比例下降，S期与G2期所占的比例增高，这说明HBx可能有加速细胞周期，促进细胞生长，抑制细胞凋亡的作用。由此可以推断,HBx可促进细胞DNA的复制,加速细胞周期的进程,与大多文献报道相一致[9-12],所有这些表明, HBx对Bel7404肝癌细胞影响极大,可能对肝细胞癌恶性程度、转移等产生重要的影响,这对进一步研究HBx致HCC的确切机制,探索HCC新的防治策略具有十分重要的启示。