低剂量辐射对荷S180肉瘤小鼠肿瘤组织HIF-1α和P53表达

     作者：李福宝,于洪升　　作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛

　　【摘要】 目的 探讨低剂量辐射对荷S180肉瘤小鼠肿瘤组织中乏氧诱导因子1α(HIF-1α)、P53表达的影响。方法 昆明种小鼠皮下接种S180肉瘤细胞，待肿瘤形成后(第12天)将小鼠随机分成假照(N)组及低剂量辐射(LDR)组。LDR组小鼠给予一次性75 mGy 60Co射线全身照射，N组小鼠予以无射线假照射。进行小鼠一般状态观察，N组于假照射后6 h处死，LDR组分别于照射后6 h(LDR-6 h组)、12 h(LDR-12 h组)、24 h(LDR-24 h组)、48 h(LDR-48 h组)、72 h(LDR-72 h组)处死。分别取瘤称瘤质量，行免疫组化染色检测肿瘤组织中HIF-1α、P53表达情况。结果 LDR各组瘤质量与N组比较无统计学差异(P>0.05)。LDR-24 h组、LDR-48 h组、LDR-72 h组HIF-1α、P53的表达与N组比较均有统计学差异(T=59.000～139.500,P<0.05)。结论 荷瘤小鼠低剂量全身照射后72 h内肿瘤质量无明显变化，HIF-1α及P53的表达均降低。一定程度上表明低剂量全身照射一定时间内可降低HIF-1α及P53的表达，从而改善肿瘤乏氧。

　　【关键词】 低剂量辐射 乏氧 S180肉瘤 HIF-1α P53 蛋白质

　　大部分恶性肿瘤均存在不同程度的乏氧。一系列的体外实验也证明,乏氧可以影响肿瘤放射治疗的疗效[1]。乏氧的存在能使肿瘤细胞的一些蛋白的合成或表达增加,包括氧调节蛋白(如糖酵解酶等)、血管内皮生长因子(VEGF)和P53等〖2,3〗。这些蛋白变化使肿瘤细胞在适应乏氧微环境的同时,引起肿瘤自身的侵袭性增加和对放疗的抗拒，而在这个过程中乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)起着中枢纽带作用,因为乏氧引起的上述蛋白的变化大多是通过HIF-1α起作用的。为此,本实验拟通过观察低剂量辐射对荷S180肉瘤小鼠肿瘤组织中HIF-1α、P53的影响，研究低剂量辐射对肿瘤乏氧的影响。现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与动物

　　SPF级昆明种小鼠(购自青岛市药品检验所)，雄性，体质量20～22 g，4～6周龄，常规饲养，不限食物。小鼠S180肉瘤细胞(购自山东省药品检验所)，腹水传代，第二代用于实验。HIF-1α与P53鼠抗人单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 动物模型的建立

　　S180肉瘤细胞腹腔传代6 d后，无菌抽取腹水2 mL(淡黄澄清腹水)，加入3倍无菌生理盐水稀释，锥虫蓝计数，细胞活力大于95%时，调细胞浓度至1×1010/L。实验小鼠右后肢皮肤消毒，皮下接种0.2 mL肿瘤细胞悬液，整个过程于1 h内完成。 齐鲁医学杂志2009年6月第24卷第3期 Med J Qilu, June 2009, Vol.24, No.30

　　1.3 照射条件

　　小鼠常规饲养，观察肿瘤生长。第12天将荷瘤小鼠随机分为：假照组(N组)、低剂量辐射组(LDR组)。所有LDR组小鼠接受60Co全身照射，使用自制纸盒盛装小鼠，源皮距为110.5 cm,照射野面积30 cm×30 cm, 射线剂量率12.5 mGy/min, 照射时间6.25 min,总剂量75 mGy，均为一次性全身照射。N组接受无射线假照射。

　　1.4 标本采集

　　将受照射小鼠随机分成5组，分别于照射后6 h(LDR-6 h组)、12 h(LDR-12 h组)、24 h(LDR-24 h组)、48 h(LDR-48 h组)、72 h(LDR-72 h组)处死;N组于假照射后6 h处死。完整剥离皮下瘤结节，肉眼观察肿瘤大体标本，使用精度为1 mg的天平称质量，将肿瘤组织迅速置于40 g/L的甲醛溶液中固定。

　　1.5 检测项目与方法

　　1.5.1 称瘤质量 将剥离的皮下瘤结节用精度为1 mg天平称质量。

　　1.5.2 瘤组织标本HIF-1α和P53的检测 采用免疫组化PowerVision TM二步法,以PBS代替一抗作为阴性对照。 以细胞浆出现浅黄色、棕黄色或褐黄色颗粒为HIF-1α、P53阳性。低倍镜下选取视野，高倍镜下观察计数，每100个细胞中阳性细胞数0～5个为-、6～10个为+、>10个为。

　　1.6 统计学处理

　　采用SPSS 11.5统计软件包,瘤质量数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析;HIF-1α、P53数据以等级资料表示，组间比较采用等级秩和检验。

　　2 结 果

　　2.1 小鼠一般状态及各组瘤质量比较

　　照射后6 h观察小鼠一般状态，低剂量辐射各组小鼠比N组小鼠的精神状态更好，更活跃。N组和LDR各组小鼠的瘤质量分别为(1.22±0.15)、(1.12±0.17)、(1.22±0.27)、(1.18±0.22)、(1.05±0.29)、(1.16±0.19)g，各组间瘤质量比较无统计学差异(F=0.83,P>0.05)。

　　2.2 HIF-1α、P53免疫组化检测

　　LDR-24 h组、LDR-48 h组以及LDR-72 h组HIF-1α、P53的表达与N组比较有统计学意义(T=59.000～139.500,P<0.05)。表1 各组HIF-1α、P53免疫组化检测结果

　　3 讨 论

　　乏氧是恶性实体肿瘤普遍存在的现象，它的存在不仅使肿瘤对放、化疗的抗拒性增加，而且使肿瘤更具侵袭性，容易发生远处转移[4]。ADAMS等[5]概括了乏氧可诱导的分子事件如下:对放化疗更为耐受;诱导血管生成;上调信号传导水平;上调野生型P53表达水平;改变细胞表面黏附分子的表达水平;诱导细胞内还原酶的合成;诱导NO合成酶的生成等。现在人们已认识到在乏氧状态下,肿瘤细胞是通过自身的一些内源性基因表达变化来适应其赖于生长的微环境，目前已知这些内源性基因包括HIF-1、碳酸酐酶9、VEGF、P53等[6]。其中HIF-1和P53很受人关注。HIF-1是1992年由SEMENZA[7]发现并于1995年克隆表达的细胞转录因子。研究表明该转录因子属于bHLH-PAS蛋白家族,它是由HIF-1α和HIF-1β各两个亚单位组成的杂合二聚体[6]。其中,亚单位HIF-1α对氧的依赖性较强,主要表现为在乏氧时其蛋白稳定性增加,降解减少,引起在蛋白水平表达增加;而在富氧时降解增加,导致在蛋白水平表达下降[8]。现在大部分研究主要集中在HIF-1α蛋白水平方面。研究结果显示，HIF-1α蛋白表达水平与其他测定乏氧的方法有较好的相关性,提示HIF-1α可作为一个乏氧标志物[9]。在临床应用方面,HIF-1α作为一个提示预后的指标也得到了广泛研究〖10,11〗。 HIF-1α对细胞凋亡的影响近年国外渐有报道,肿瘤细胞的凋亡有P53依赖性和P53非依赖性两条途径,而乏氧是通过HIF-1为中介的P53依赖途径起作用的。CARMELIET等[12]报道，乏氧时野生型胚胎干细胞(ES,HIF-1α+/+)的HIF-1α和P53 表达均增加,而ES(HIF-1α-/-)因缺乏HIF-1α,其P53表达并不增高。

　　LDR是指照射剂量在0.2 Gy 以内的低LET射线或5 cGy以内的高LET射线,同时剂量率在0.005 cGy/min 以内。LDR抗肿瘤效应的深入研究在恶性肿瘤的治疗中有很大的发展前景。国内外学者从不同角度对低剂量电离辐射的抗瘤作用进行了大量研究,证明低剂量全身或仅是脾区辐射可刺激动物的生长、发育,可延长动物寿命,提高生育力。同时，还发现可增强动物和人体的免疫功能,促进肿瘤细胞的凋亡，降低肿瘤发生率以及对肿瘤治疗起到协同作用等[13]。陈玉丙等[14]采用S180腹水肉瘤细胞株荷瘤昆明系雌性小鼠作为实验模型,实验结果也表明，荷瘤机体预先接受低剂量的全身照射可增强肿瘤局部放疗剂量照射对肿瘤的抑制作用,提高放疗效果,75 mGy的增强效应好。IAKIMOVA等[15]在颈部恶性肿瘤放疗前给予0.1 Gy的γ射线预先照射,病人5年存活率增加了14%,而放疗反应及并发症的发生率显著下降。

　　本实验观察了LDR对荷S180肉瘤小鼠肿瘤组织中HIF-1α、P53表达的影响，结果显示，LDR各组瘤质量与N组比较无统计学差异;LDR-24 h组、LDR-48 h组、LDR-72 h组HIF-1α、P53的表达与N组比较均有统计学差异。在一定程度上表明，低剂量全身照射一定时间内可降低HIF-1α及P53的表达，从而改善肿瘤的乏氧状况。

　　低剂量全身照射的抑瘤作用已经证实，且已经应用于临床肿瘤的治疗中，其独特的生物学效应可与现有的治疗手段互补，尤其在放化疗增敏以及减轻放化疗副作用方面显示了其优势。但目前普遍认为单纯依靠低剂量全身照射治疗肿瘤是不够的，尤其是不能作为单独治疗恶性肿瘤方案。LDR的抑瘤机制尚不甚明确，有关低剂量全身照射与其他治疗协同作用于机体产生复合生物学效应方面的研究较少，尚未形成成熟的综合治疗模式，限制了这一治疗手段应用于临床实践。