肾素-血管紧张素系统基因多态性与冠心病合并慢性心力衰竭的关系

　　作者：牛云茜,罗礼云,彭健,梅啸,彭澍,龚五　　作者单位：1. 中山大学附属第五医院心内二科; 2. 珠海市第二人民医院心内科;3. 暨南大学附属第三医院心内科; 4. 暨南大学附属第三医院分子生物实验中心， 广东 珠海 　　

　　慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是严重危害人类健康的常见病，其病因迄今尚未阐明。CHF与肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)基因多态性间关系的研究已成为其病因学研究的一个热点[1]，人们日益关注的因人而异的CHF个体化治疗策略亦有赖于CHF遗传病因学研究的不断深入与扩展[2]。但对于RAS基因多态性与CHF发生、发展的关系，目前国内外的研究仅处于初步阶段，且研究结果并不一致，尤其是对双位点联合研究的观察较少[1]。RAS在维持体内水电解质平衡、调节血管张力以及CHF的发生、发展过程中起重要作用，血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)和血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)是RAS中的两个关键成分。本研究通过检测ACE和AGT基因多态性在中国南方部分汉族人群冠心病患者中的分布，以探讨两基因多态性在冠心病患者发生CHF中的作用和意义。
　　1 材料和方法
　　1.1 研究对象

　　冠心病病人共215人，均来自2004年4月至2006年12月在本院及珠海市内几家大型医院心内科住院病员，其籍贯为中国广东、广西、湖南、云南、福建等省市。所有患者均经冠状动脉造影检查，冠心病的诊断标准：左冠状动脉主干、左前降支、左回旋支及右冠状动脉中至少1支血管狭窄≥50%。病例组为冠心病合并慢性心力衰竭者共105例(合并高血压病者52例)，CHF诊断参照修改的Framingham标准，心功能NYHA分级Ⅱ～ Ⅳ级、超声心动图检测左室射血分数<45%，年龄≥18 岁，CHF病史至少≥3个月，其中男性69例，女性36例，年龄(59 ± 7)岁。对照组为研究对象中没有合并CHF者，共110 例(合并高血压病者57例)，其中男性71例，女性39例，年龄(57 ± 9)岁。排除标准：①严重肝、肾功能不全;②严重的急性感染或代谢紊乱;③急性心力衰竭;④2周内未行血运重建的急性心肌梗死者;⑤合并心瓣膜疾病者。本研究对象间无血缘关系，均为中国南方汉族成人，所有研究对象均知情同意。
　　1.2 检测指标
　　调查所有研究对象的吸烟、高血压、糖尿病及高血脂史，测量身高、体重，检测空腹血糖及血脂、血红蛋白、肝功能、肾功能。
　　1.3 人基因组DNA的提取
　　抽取外周静脉血5 mL，20 g/L EDTA抗凝，低渗法分离白细胞，经细胞裂解液及蛋白酶K消化，酚/氯仿/异戊醇方法提取基因组DNA，无水乙醇沉淀，保存于TE溶液中。
　　1.4 ACE基因I/D多态性检测
　　引物序列：P1，5′-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3′;P2，5′-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3′。聚合酶链反应体系总体积共20 μL，其中模板DNA 1 μL，10×缓冲液 2 μL，0.5 U/μL Pfu DNA聚合酶1 μL，10 μmmol /L的 P1及P2各1 μL, 2 mmol/L dNTP 2 μL。在PE-2400全自动基因扩增仪上扩增，94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min ，72 ℃延伸1.5 min ，循环30次，72 ℃终末延伸5 min。反应产物在含有溴化乙锭的10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，电压100 V，30 min，紫外灯下观察基因分型[3]。
　　1.5 AGT基因M235T多态性检测
　　引物序列：P1， 5′-CAG GGT GCT GTC CAC ACT GGA CCC C-3′, P2， 5′-CCG TTT GTG CAG GGC CTG GCT CTCT-3′。聚合酶链反应体系总体积共30 μL，其中模板DNA1.5 μL，10×缓冲液3 μL，1 U/μL Pfu DNA聚合酶1 μL， 12 μmmol/L 的P1及P2各1 μL，2 mmol/L dNTP 3 μL。在PE-2400全自动基因扩增仪上扩增，94 ℃变性1 min，65 ℃退火1 min ，72 ℃延伸1.5 min ，循环30次，72 ℃终末延伸5 min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。酶切反应体系总体积共20 μL，其中PCR产物10 μL，Tth111 I内切酶(Fermentas公司)1 μL，10×缓冲液 2 μL，无菌去离子水7 μL，混匀后置37 ℃水浴箱中水浴16 h。酶切反应产物含有溴化乙锭的30 g/L琼脂糖凝胶上电泳[4]。
　　1.6 统计分析

　　应用SPSS15.0 for Windows 进行统计分析。组间均数比较用t检验，基因型分布及等位基因频率比较用χ2检验。基因型及等位基因相对危险度以优势比(OR)及其95%置信区间(CI)表示，应用二项Logistic回归分析冠心病患者发生CHF的易患因素。P < 0.05为差异具有统计学意义。
　　2 结果

　　2.1 两组一般临床资料的比较

　　两组在年龄、性别构成、病程、既往曾发生心肌梗死的例次、吸烟率、体重指数、收缩压、舒张压、血红蛋白(HGB)、空腹血糖(BS)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)等方面无统计学差异。病例组甘油三酯(TG)低于对照组，血肌酐(Cr)高于对照组(P < 0.05)。
　　2.2 Hardy-Weinberg平衡检测
　　本组资料中，对照组ACE及AGT基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2分别为3.750和0.078，P > 0.05)，表明该群体为遗传平衡群体，本研究资料具有群体代表性。
　　2.3 两组基因型频率及等位基因频率的比较
　　2.3.1 病例组和对照组ACE基因I/D多态性分布
　　病例组DD基因型频率明显高于对照组，与非DD型相比，DD型者发生CHF的OR为2.721(95%CI:1.517 ～ 4.878)。同时，D等位基因频率也较对照组高(表1)。
　　2.3.2 病例组和对照组AGT基因M235T多态性分布 两组TT基因型频率无统计学差异。同时，T等位基因频率分布亦无统计学差异(表2)。
　　2.4 ACE基因I/D及AGT基因M235T多态性的联合分析

　　病例组及对照组中同时具有ACE基因DD型及AGT基因TT型者的频率分别为27.6%及14.5%，前者高于后者(表3)。
　　2.5 非条件Logistic回归分析冠心病患者CHF的易患因素
　　以ACE基因型、AGT基因型、性别、年龄、病程、吸烟史、收缩压及舒张压、TC、TG、LDL-C、HGB、空腹血糖为自变量，以冠心病患者是否发生CHF为因变量，并定义ACE基因型、AGT基因型、性别和吸烟史为分类变量，用Forward:Ward法建立非条件Logistic回归模型进行多因素分析，结果表明，ACE基因型及TG与冠心病患者发生CHF相关，而AGT基因型、病程、血压等其他因素被剔除(表4)。以II型为参照，DD型发病的OR为5.215。联合ACE基因型及AGT基因型建立回归模型，结果ACE基因型及AGT基因型、TC 、HGB被引入方程，其他因素被剔除(表5)。表明DD+TT、DD+MT、DI+TT基因型、HGB、TG参与总体冠心病患者CHF发生的概率。以II+MM型为参照，DD+TT基因型发病的OR为5.039。
　　3 讨 论
　　不同的冠心病患者在临床表型及预后等方面存在着显著的差别，部分患者发生CHF的时间明显较其他患者早，心功能恶化的程度亦较严重。除已知的危险与干预因素影响外，个体基因的不同与变异可能在CHF的发生与发展及治疗转归等方面起不容忽视的重要作用[1，2]。
　　3.1 ACE基因I/D多态性与CHF

　　近年来ACE基因I/D多态性与心血管疾病遗传易感性及临床表现的关系已受到国内外学者的关注。研究证实，ACE基因多态性与体内ACE水平及左室重构、左室功能有关，DD基因型的血清ACE水平高[5，6]。karaali等[7]则发现心肌梗死后左室肥厚 ( left ventricular hypertrophy ,LVH)与ACE基因多态性相关，DD基因型增加心梗后LVH的风险。俄罗斯学者也曾对发生过心肌梗死的冠心病患者进行研究，结果表明DD-ACE基因型及D等位基因会增加冠心病患者CHF的发生几率，而且该基因型可作为心功能恶化程度的一个标志[8]。但也有研究发现DD-ACE基因型并不增加冠心病患者发生CHF的风险[9]。本研究以215例冠心病患者作为研究对象，其中合并CHF者的DD基因型及D等位基因频率明显高于心功能正常者，提示ACE基因I/D多态性与中国南方部分汉族人群冠心病患者发生CHF有关，DD型ACE基因可能是该地区冠心病患者CHF发病的遗传危险因素。关于ACE基因多态性、ACE与CHF的发病机理仍尚待阐明，多数学者认为ACE基因可能是通过影响了血清和内皮细胞中的ACE水平而影响了外周或局部循环中的血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)和缓激肽浓度。外周AngⅡ具有强大的缩血管作用，且能刺激醛固酮的释放和增强交感神经释放去甲肾上腺素，从而使心室的前、后负荷均明显增加。同时AngⅡ可在局部组织生成并独立发挥调控作用。实验研究表明，肥大心肌中AGT及ACE的表达，以及AngⅡ的含量均明显增加[10]。AngⅡ可通过其受体刺激心肌细胞肥大和成纤维细胞增殖并使两者的表型改变，从而终导致心肌重构和心功能恶化。
　　3.2 AGT基因M235T多态性与CHF

　　RAS中的另一关键成分AGT基因M235T多态性与较高的血浆血管紧张素原水平、高血压及左室肥厚相关[11]。关于该基因多态性与CHF的关联性研究国内外开展较少，新的一项研究发现，携带TT型AGT基因的高血压患者发生CHF的危险性增加，且发病年龄较其他基因型者早约十年[12]。但其与冠心病患者发生CHF的关联性资料尚缺乏研究，我们初次探讨了AGT基因多态性在冠心病患者发生CHF中的作用，结果发现AGT M235T 基因型的分布在冠心病合并CHF组及对照者间无明显差异，提示该人群的AGT M235T 基因多态性与冠心病患者发生CHF似无关。其原因可能是由于心血管疾病在遗传方面的特点是受多个微效基因及基因与基因、基因与环境之间诸多相互作用的影响，而单一基因实难发挥决定性临床表型作用。
　　3.3 ACE I/D及AGT M235T双基因多态性与CHF

　　CHF是多基因疾病,仅分析单个基因获得的信息量较少,结果不甚可靠。宜选择多个候选基因客观地从不同侧面分析，既需探讨某一基因多态性的作用，更需要对不同候选基因之间的相互作用进行分析。本研究联合分析了ACE I/D和AGT M235T 基因多态性与冠心病患者发生CHF的关系，结果表明冠心病合并CHF组ACE-DD + AGT-TT基因型频率明显高于对照组，进一步应用二项Logistic回归分析CHF的易患因素发现，ACE和AGT基因在冠心病患者CHF的发生中具有协同作用，以II + MM型为参照，DD+TT基因型发病的OR为5.039，高于ACE-DD型单基因发生CHF的OR(2.721)，DD型基因的冠心病患者若同时携带有TT基因，发生CHF的几率明显增高。
　　本研究进一步佐证了我们之前的观点：肾素-血管紧张素系统基因多态性与CHF的发生及病情严重程度存在关联，DD-ACE基因型是CHF发生的危险因素，且携带DD基因型的CHF患者病情更加严重[13]。