子宫内膜癌组织中Bim Bax mRNA表达及相关性研究

作者：张静,朱志洁,朴锦丹,徐荣春 　　作者单位：

　　【关键词】 Bim,Bax,子宫内膜癌 摘 要：目的 探讨促凋亡基因Bim、Bax mRNA在子宫内膜癌发生发展中的作用。方法 RTPCR方法检测17例正常增殖期子宫内膜、11例非典型增生子宫内膜及52例子宫内膜癌中Bim mRNA、Bax mRNA的表达。结果 Bim mRNA在正常增殖期内膜、非典型增生内膜及子宫内膜腺癌组织中表达量逐渐减少，且差异显著(P<0.05)。Bax mRNA在正常增殖期内膜、非典型增生内膜及子宫内膜腺癌组织中表达量逐渐增加，有明显统计学差异(P<0.05)。在不同病理分级、不同手术病理分期及肌层浸润深度的子宫内膜腺癌组织中，Bim mRNA及Bax mRNA阳性表达量无明显差异(P>0.05)。相关分析结果显示在不同子宫内膜组织中，Bim mRNA与Bax mRNA表达呈明显负相关(P<0.05)。结论 Bim、Bax 表达改变与子宫内膜癌的发生密切相关。
　　关 键 词：Bim;Bax;子宫内膜癌
　　ex[x]pressions and relativity of Bim and Bax genes in endometrial adenocarcinoma ZHANG Jing, ZHU Zhijie, PIAO Jindan, XU Rongchun (Department of Obstetrics and Gynecology, Daqing General Oil Field Hospital, Daqing, Heilongjiang Province, 163001, China)

　　Abstract:ob[x]jective To investigate the mRNA ex[x]pression of Bim and Bax in the occurence of endometrial carcinoma. Methods Detect the ex[x]pression of Bim and Bax mRNA in 52 cases with endometrial carcinoma and 11 atypical cases with endometrial hyperplasia by RTPCR, 17 cases with normal endometrium as control. Results The ex[x]pression level of Bim mRNA in normal endometrium was the highest, and decreased in atypical hyperplasia and endometrial adenocarcinoma tissues .The difference of the three tissues were signifcant(P<0.05). The ex[x]pression level of Bax mRNA in normal endometrium was the lowest, and increased in atypical hyperplasia and endometrial adenocarcinoma tissues. The difference of the three tissues were signifcant(P<0.05). In endometrial adenocarcinoma tissues with different clinical stage, pathological grade and muscular invasion, the ex[x]pression of the mRNA of Bim and Bax were not signifcant(P>0.05).The ex[x]pression of Bim mRNA and Bax mRNA in endometrium is negative related (P<0.05). Conclusion Bim can interact with Bax and lead to the occurrence of endometrial adenocarcinoma. Key words:Bim; Bax; endometrial carcinoma

　　子宫内膜癌是女性生殖道常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈上升趋势。因其发病原因尚不明确，缺乏有效的预防及治疗措施，严重威胁女性健康。Bcl2蛋白家族与肿瘤的发生密切相关，Bim作为Bcl2家族的促凋亡成员[1]，属于“仅含BH3域蛋白”(BH3only protein)，而BH3域被认为是细胞凋亡起始的必需因子。已有研究证明在多种癌症的发病过程中存在有Bim蛋白表达的改变[2-3]，Bim激活后可以通过Bax(Bclassociated X protein)构象改变而调节细胞凋亡[4]。目前国内外尚没有关于子宫内膜癌中Bim mRNA与Bax mRNA表达改变的研究，本研究采用逆转录聚合酶链法(RTPCR)研究二者在不同内膜组织中的表达，旨在探讨其在子宫内膜癌发生与发展中的作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 标本来源

　　选用2002年10月~2004年7月我院妇产科收治的子宫内膜病变患者63例，其中子宫内膜癌52例、子宫内膜非典型增生11例，选取同期宫腔镜手术获得的正常增殖期子宫内膜组织17例作为对照组，年龄为22～71岁。所有标本均经HE染色和组织学观察确定诊断，所有患者术前均未接受过放疗、化疗或激素治疗。其中子宫内膜癌按2000年FIGO分期标准进行临床分期：I期22例(其中2例无肌层浸润;13例肌层浸润≤1/2;7例肌层浸润≥1/2)，II期12例，III期18例。病理分级：G1级25例，G2级15例，G3级12例。组织学类型均为子宫内膜腺癌。80例新鲜组织标本均为手术时立即取材，取材时所用器皿均经高压消毒处理。标本一部分经10%福尔马林固定，常规脱水、包埋，行HE染色，以供病理学检查。其余新鲜部分置液氮冷冻后，送-70℃深冻冰箱保存。
　　1.2 方 法
　　RNAPCRkit试剂盒，Taq酶，MARKER，RNA裂解液，PCR引物。PCR引物序列由Primer 5.0软件设计，由北京奥科生物技术有限责任公司合成并纯化，溶于无菌去离子水至25 pmol/μl，序列如下：

　　Bim sence： 5'ATC TCA GAG CAA TGG CTT CC3'，Bim antisence：5' ATT CGT GGG TGG TCT TCG3'，产物大小163bp;

　　Bax sence：5'GCA GAG GAT TGC TGA TG3'，Bax antisence：5'CTC AGC CCA TAT TCT TCC AG3'，产物大小354bp;

　　βactin sence： 5'GAT TGC CTC AGG ACA TTT CTG3'，βactin antisence：5'GAT TGC TCA GGA CAT TTC TG3'，产物大小690bp。
　　1.3 RTPCR试验

　　组织标本收集及处理：全部标本均在离体后即刻无菌取材，置入高压灭菌的EP管中，取所需组织约0.1 g左右，0.9%生理盐水洗净血液，立即置入液氮备用。
　　组织总RNA的提取，逆转录(reverse transc[x]ription, RT)：模板RNA约为2 μl，加入50 μmol寡聚胸腺嘧啶核苷酸[Oligo(dT)15]1 μl、40 U/μl RNA酶抑制剂(RNAsin)0.5 μl、25 mmol MgSO4缓冲液4μl、2×buffer 10 μl、AMV逆转录酶1 μl、dNTP 1 μl，加去离子水至终体积为20 μl。反应条件：65℃ 1 min，30℃ 5 min，15~30 min内匀速升温，65℃ 30min，98℃ 5 min，5℃ 5 min。逆转录产物置于4℃保存。
　　逆转录聚合酶链反应(RTPCR)：所有引物均为北京奥科生物技术有限责任公司合成，以βactin为内参照，用PCR扩增各目的基因。反应体系为25μl：模板cDNA 3 μl;10×buffer 2.5 μl;dNTP 2μl;各引物均为0.5 μl;Taq DNA聚合酶0.2 μl;加三蒸去离子水至总体积为25 μl。
　　基因扩增条件：
　　Bim起始变性为94℃ 3 min，然后执行如下反应条件：94℃变性45 s，52.3℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，后72℃延伸7 min。
　　Bax起始变性94℃ 5 min，然后执行如下反应条件：94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环，后72℃延伸5 min。
　　1.4 结果判定

　　PCR产物电泳及结果判定分析：取PCR产物5 μl，2%琼脂糖凝胶电泳，置于1D Kodak 成像分析系统观察，电脑摄像储存。与标准带(即内参照条带)比较，计算目的基因RTPCR产物吸光度容积与βactin基因RTPCR产物吸光度容积比值，作为目的基因mRNA的相对含量。
　　1.5 统计学分析
　　应用spss11.0软件进行方差分析及相关分析，P<0.05提示差异显著。
　　2 结 果
　　2.1 不同组织间Bim及Bax mRNA表达的检测
　　RTPCR扩增后的内标基因βactin为690 bp，所有组织中均有稳定表达。各目的基因扩增产物经电泳后，紫外透射仪下可见扩增的特异产物条带，且目的基因片段产物与引物设计之目的片段大小完全吻合。
　　2.2 不同组织间及病理分级中Bim及Bax mRNA表达量的差异

　　应用RTPCR技术半定量检测组织中目的基因含量，Bim mRNA在正常增殖期内膜、非典型增生内膜及子宫内膜腺癌组织间表达量逐渐减少，且差异显著(F=29.8，P<0.05)，非典型增生内膜及子宫内膜腺癌组织中表达量与正常内膜组织相比均有显著差异(P<0.05)。在高中分化腺癌中，Bim表达量比正常内膜及非典型增生内膜降低，在低分化腺癌中Bim表达略增加，不同病理分级相比无显著差别(P>0.05)。
　　Bax mRNA在这三种子宫内膜组织中的表达量逐渐增加，有明显统计学差异(F=17.2，P<0.05)。Bax mRNA在低分化腺癌中表达较高、中分化腺癌增加，但无显著性差异(P>0.05)。在不同临床分期及肌层浸润程度的子宫内膜腺癌中，Bim mRNA及Bax mRNA阳性表达量无明显差异。见表1。 表 1 不同子宫内膜组织中Bim mRNA与Bax mRNA的表达
　　2.3 不同类型的子宫内膜组织中Bim mRNA及Bax mRNA 表达的相关性相关分析结果显示，在不同子宫内膜组织中，Bim mRNA与Bax mRNA表达呈明显负相关

　　3 讨 论
　　3.1 Bim基因

　　Bcl2家族蛋白是调节凋亡的关键调节子，Bcl2家族成员都含有3个或4个特征性同源区域。根据Bcl2家族促凋亡成员的结构及生物学功能可被分为两组：Bax、Bak等含2个或3个BH区域;Bad、Bim等仅含有BH3区域，被称为BOPs。到目前为止，所有被鉴定的BOPs家族成员都是促凋亡的，是程序性细胞死亡的必须启动子，这些蛋白参与识别不同类型的刺激，通过灭活Bcl2家族中促生存成员的保护功能，并激活促凋亡的家族成员来发动凋亡。
　　Bim是近年发现的BOPs家族中重要的一员，定位于7p15.2，编码含129个氨基酸的蛋白质。已有研究证明BH3域可能通过启动促凋亡蛋白如Bax的功能，导致细胞色素C自线粒体向细胞浆的释放，启动Caspases，进而诱发细胞凋亡; Bax/BOPs是线粒体完整性的关键调节者，其平衡状态决定线粒体是保持完整还是通透性增强、释放蛋白引起死亡。
　　本研究对子宫内膜腺癌发生过程中细胞Bim mRNA的表达进行了检测，结果显示Bim mRNA在非典型增生子宫内膜中的表达量明显降低，在高中分化内膜腺癌细胞内降低更加明显，提示Bim阴性表达可能与子宫内膜腺癌发生的早期阶段有关，认为Bim基因在肿瘤发生的多步骤过程中的早期阶段发挥作用，而一旦转化细胞获得恶性表型，Bim基因似乎不再起主要作用，这与Nakamura的研究结果基本相同。
　　3.2 Bax基因

　　Bax是1993年Oltvai等用Bcl2基因蛋白产物Bc2特异性单克隆抗体免疫沉淀等方法发现的一种蛋白质。有研究发现，位于线粒体的Bim能与Bax相互作用，Bax能降低细胞凋亡的阈值，也能通过直接影响线粒体功能和膜的完整性而调节凋亡，其中线粒体通透性转变涉及线粒体内膜中一个大信道的打开，其产生的效应可能对细胞死亡诱导起作用，包括产生氧自由基、将储存的钙离子泵入胞浆、释放线粒体蛋白到胞浆中激活Caspases，而发挥其诱导凋亡的作用。
　　本实验结果提示，Bax 在子宫内膜非典型增生组织中表达开始增高，说明在细胞过度及异常增殖的早期，细胞增殖开始活跃，凋亡也相应活跃，在子宫内膜腺癌中Bax表达明显增高，随着病理分级的增加Bax表达量亦逐渐增加，说明随着子宫内膜腺癌恶性程度的增加及分化程度降低，细胞恶性增殖更加活跃，由此推断Bax与肿瘤的临床生物学行为有关。
　　3.3 Bim与Bax的关系
　　有研究表明[5]Bim及其它仅含BH3区域的蛋白如Bid、Bad及Noxa无法杀死缺乏Bax及Bak的胚胎成纤维细胞，但可以杀死仅含有这两个基因任一拷贝的细胞，这些发现提示仅含BH3区域蛋白的杀细胞活性发挥需要Bax/Bak类蛋白的存在，反之，Bax/Bak类蛋白需要来自仅含BH3区域蛋白的细胞杀伤信号，这些信号感受细胞应激并被激活。
　　本研究的实验结果显示在子宫内膜腺癌的发生中，Bim mRNA与Bax mRNA之间存在负相关性，提示Bim可能通过Bax发挥调节凋亡的功能，这些功能为凋亡启始所必需，Bim可能使Bax构像改变，或者通过后滞激活作用发挥其抗凋亡的作用。但也有文献认为Bim的促凋亡作用与Bax无关，我们将在后续实验中具体研究二者相互作用的机制。
　　总之，BOPs家族成员在细胞凋亡调控中起关键作用，Bim与Bax在子宫内膜腺癌的发病机制中起重要作用，联合检测Bim与Bax表达可能对子宫内膜腺癌的早期诊断及预后判断有重要的意义。
　　参考文献：

　　[1] O' Connor L, Strasser A, O' Reilly L A, et al. Bim: a novel member of the Bcl2 family that promotes apoptosis[J]. EMBO J, 1998, 17(2): 384-395.

　　[2] Jiang Z, Zheng X, Lytle R A, et al. Lovastatininduced upregulation of the BH3only protein, Bim, and cell death in glioblastoma cells[J]. J Neurochem, 2004, 89(1): 168-178.

　　[3] Sunters A, Fernandez de Mattos S, Stahl M, et al. FoxO3a transc[x]riptional regulation of Bim controls apoptosis in paclitaxeltreated breast cancer cell lines[J]. J Biol Chem. 2003, 278(50): 49795-49805.

　　[4] Srasser A, Puthalakath H, Bouillet P, et al. The role of bim, a proapoptotic BH3only member of the Bcl2 family in celldeath control[J]. Ann N Y Acad Sci. 2000, 917: 541-548.

　　[5] Wuwana T, BouchierHayes L, Chipuk J E,et al. BH3 domains of BH3only proteins differentially regulate Baxmediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly[J]. Mol Cell, 2005, 17(4): 525-535.