大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定

作者：徐索文1,肖平喜2,陈健文1,乐康1　　作者单位：1 510006 广东广州，中山大学药学院药理毒理实验室　2 210006 江苏南京，南京医科大学附属南京医院心内科
　　【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。
　　【关键词】 大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞

　　[Abstract]ob[x]jectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed by modified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys” morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.

　　[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells

　　血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成 (neointima formation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关[1~4]。因此，研究防治VSMCs增殖与迁移成为血管生物学领域研究的热点。本研究在参考国内外文献的基础上[5~8]，结合自己的经验，采用改良的植块贴壁法成功建立了大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型。
　　1材料与方法
　　1.1动物与试剂SPF级雄性SD大鼠1只，体重(150±10)g，中山大学实验动物中心提供，合格证号(粤监证字2006A064)。DMEM (Gibco) 、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所) 、胰蛋白酶(trypsin , Sigma) 、T25 塑料培养瓶(Costar) 、特异性鼠平滑肌肌动蛋白抗体 、SABC试剂盒 、DAB 显色试剂盒 (武汉博士德公司) 、FITC标记的羊抗鼠荧光二抗(Santa Cruz Biochem)

　　1.2大鼠VSMCs的分离与原代培养SPF级雄性SD大鼠1只, 重约150g，颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒2min，同时用酒精浇灌大鼠的胸腹部，移入超净台内。无菌条件下迅速取出全段胸主动脉, 立即移入含冷PBS的无菌平皿中。使用 1ml的一次性注射器拔去针尖后吸取PBS清洗去除血污，眼科镊去外膜结缔组织，此时将洁净血管转移到另一含冷PBS的无菌平皿中，用眼科剪小心剪去血管绒毛后用两弯镊反向牵拉去除外膜，再用眼科弯镊穿过血管沿两端来回牵拉一次，纵向剖开血管，使内膜面朝上,并用弯镊摊平血管，再将血管转移到含DMEM (10%胎牛血清)的无菌平皿中，用DMEM培养液清洗中膜层平滑肌数次后，用眼科弯剪剪切成约1mm3大小的组织块;将组织块(约15个小块/段血管)均匀贴放于25cm2培养瓶底的一处角落，间距0.1cm; 向瓶内加入2ml含20%胎牛血清的DMEM培养液，将培养瓶直立置于37℃、5%CO2 培养箱中6h，使组织块干涸并与瓶壁牢固贴附。6h后再次翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中, 培养箱中静置培养3天后，细胞从组织块边缘游出后更换培养液，隔天换液1次;当细胞80%融合时,即可传代。
　　1.3VSMCs的传代培养当组织块周围外长的细胞相互汇合达80%融合时，即可传代：超净台内，吸弃旧培养液, 将组织块转入一新培养瓶加入培养基继续培养。用不含血清的DMEM培养液洗涤细胞2 次，加入0.125%胰酶和0.02%EDTA混合消化液2ml，室温下消化20s后转移到37℃培养箱中消化1min，镜下观察，当发现细胞回缩、间隙增大并有少数细胞脱落时，弃消化液，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液10ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞成单细胞悬液，按1 ∶3 接种，细胞密度保持在1×106cells/ml，约3天长满单层，用同法继续传代培养。
　　1.4台盼蓝染色鉴定传代细胞活力取消化传代的第3代VSMCs悬液9滴，加入1滴0.4%台盼蓝液 (Sigma)，立即混匀后吸取1滴于细胞计数板上，置光学显微镜下观察：不着色细胞为活细胞。随机计数5个视野，共计数500个细胞，按成活率=不着色细胞数/500×计算细胞成活率。
　　1.5VSMCs的鉴定
　　1.5.1VSMCs的形态学观察组织块接种2天后，在倒置相差显微镜下连续观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等，并拍照记录。
　　1.5.2VSMCs的免疫组化鉴定取第3代对数生长期的细胞悬液以1×106cells/ml接种到预先放置盖玻片的6孔板中, 置37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞长成致密单层时取出盖玻片, PBS 漂洗5 min ×3 次，4 %多聚甲醛室温下固定20～30 min，PBS 再次漂洗5min ×3 次，然后按照SABC免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒说明书逐条进行操作(一抗是抗鼠平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体)。然后以苏木素复染，封固，并于相差显微镜下观察摄照。以细胞胞浆呈棕黄色为阳性细胞,计数500个细胞,计算阳性率。
　　1.5.3免疫荧光染色取第3代细胞进行细胞爬片，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，1% TritonX-100 渗透细胞膜30min, 正常山羊血清37℃封闭60min, 加一抗(α-SM-actin 1：200稀释，Boster)4℃孵育过夜, PBS洗3次，加入FITC标记的山羊抗鼠二抗(Santa Cruz)37℃避光孵育1h，PBS洗3次，加入5μg/ml Hoechest 33342，室温孵育5～10min，PBS充分冲洗，甘油封片，移荧光显微镜下(Olympus, Tokyo, Japan)观察摄片。
　　1.6VSMC的生长曲线取生长状况良好的第3代细胞，常规胰酶消化传代，制成细胞密度1×104cells/ml 的单细胞悬液，接种于24孔板，500μl/孔，置37 ℃、5 %CO2培养箱中培养,每隔24h收集3孔，加入50μl MTT(5mg/ml)继续培养4h，倾去液体，加入750μl DMSO溶解，振荡10min，转移至96孔板中，后在酶标仪上读取570nm的OD值，计算其均值。以培养时间为横轴，细胞活力(OD 570nm)为纵轴，用Sigmaplot 10.0 软件绘制VSMC的生长曲线。
　　1.7VSMCs的冻存与复苏取第 2 代对数生长期细胞，并于冻存前一天换液。消化细胞将其收集于离心管，计数，离心弃上清，加冻存液(DMSO、血清、DMEM培养基以1∶6∶3 配制，现配并置于4℃备用)，使细胞的终密度为5×106～1×107/ml，分装入1.2ml冻存管中，置4 ℃冰箱冷却1h 后转入-20℃冰箱冷却2h，后在-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中冻存。复苏时从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃水浴箱中，使其在1min内融化。酒精棉球擦拭冻存管，移入超净台，用吸管吸出细胞悬液，转移入15ml离心管中，加含20%血清的培养液，离心弃上清，再次加入培养液稀释后接种于培养瓶，放入CO2培养箱静置培养，次日更换培养液继续培养。
　　2结果

　　2.1细胞形态学观察原代培养2天后，组织块周边可见丝状物，第3天可见有少许细胞以垂直方向从组织块边缘游出 (图1A)，但不是所有的组织块周边都有。第6天,植块周围形成明显的细胞生长晕 (图1B)，细胞呈放射状排列, 进而形成细胞簇;细胞形态多样，呈梭形、多角形、星形或不规则形，有的发出细胞突起;胞浆丰富，均质透明;核卵圆居中，偶见2~3个核仁。VSMCs彼此融合、细胞密集、平行排列，密度低时常交织呈网状，密度高时则呈漩涡状或者栅栏状，在第2周形成典型的“峰”-“谷”状生长的结构特征，不见“铺路石状”排列的内皮细胞，可见此法培养的VSMCs纯度很高。而且，随着萌出细胞数量的增多和细胞的增殖，细胞间相互融合，部分重叠，2周左右可逐渐铺满整个瓶底，进行传代。A细胞动态学观察血管平滑肌细胞从组织块中游出(×100);B: 组织块贴壁6天后形态学观察(×100)A: VSMCs migrated from aorta tissue segment(×100). B: VSMCs morphology after 6 days in culture(×100)图1

　　2.2细胞鉴定

　　2.2.1免疫细胞化学鉴定第3代细胞经特异的α-SM-actin免疫细胞化学染色后，高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌α肌动蛋白丝。核卵圆形居中，呈淡蓝色,见图2A和2B。
　　2.2.2免疫荧光染色95%以上的培养细胞α-SM-actin免疫荧光染色阳性，见图2C。
　　2.3台盼蓝染色结果计数500个细胞，其中11个为阳性，约有98%的细胞染色呈阴性，表明培养的细胞消化传代后成活率较高。
　　2.4VSMCs的生长曲线以培养天数(day)为横轴，细胞活力(OD 570nm)为纵轴，在半对数坐标纸上绘制VSMC的生长曲线(图3)。如图所示，VSMCs以1×104cells/ml密度接种后第2天出现对数生长期，3～5天出现平台期，第6天出现衰退期。
　　3讨论

　　3.1VSMCs在动脉硬化研究中的应用血管平滑肌细胞是血管壁的主要细胞成分，是血管中膜惟一的细胞类型，同时又是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分之一。近年来，随着分子和细胞生物学研究的深入，人们对VSMCs表型的转化(收缩型-合成型)、增殖、迁移、分化、凋亡和细胞外基质的合成与分泌等方面的认识不断深化。目前认为：VSMCs从血管中膜迁移到内膜、增殖并分泌大量的细胞外基质以及泡沫化是动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等病理过程形成和发展中的重要因素[2,9]。已经发现，血管平滑肌细胞有两种表型：收缩型和合成型。收缩型对舒缩血管的物质可发生反应，而合成型可对一系列生长调节因子和细胞因子进行基因表达，并能合成细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)。血管平滑肌细胞增殖和迁移会引起VSMCs由生理状态下的收缩型向高度增殖的合成型的表型变化并由中膜迁移到内膜[10,11]。此外，VSMCs的凋亡在不稳定性斑块形成中扮演重要角色[12]。VSMCs的特征性抗原标记主要有α-SM-actin、Calponin、Caldesmon等[10]，本实验采用应用广泛的α-SM-actin免疫组化和免疫荧光鉴定VSMCs，结果显示95%以上的培养细胞呈阳性，说明通过本方法可获得纯度较高的VSMCs。因此，体外平滑肌细胞的培养为研究动脉粥样硬化等疾病的发病机制及其防治提供了实验基础。X轴：培养天数;Y轴：570nm光密度值X axis represents the days in culture;Y axis represents theOpticl Density read at 570nm图3血管平滑肌细胞的生长曲线Fig 3The growth curve VSMCs

　　3.2组织贴壁法与酶消化法的比较大鼠平滑肌细胞细胞株主要有A7r5、A10。商业化的人源性动脉平滑肌细胞可从ATCC (www.atcc.org)及Cascade Biologics (www.cascadebio.com)购买，但需要购买专门的平滑肌生长培养基，价格昂贵。原代培养的方法主要有酶消化法和组织块贴壁法。组织块贴壁法[13,14]，由于其血管需求量少、成本低、组织来源广泛的优点被广泛应用于血管生物学研究。其组织来源主要有大鼠胸主动脉[15]、大鼠肺动脉[16]、兔股动脉[17]、人大隐静脉[17]、脐动脉[13]、冠状动脉[11]等。酶消化法虽然培养周期短，但有以下缺点：(1)所需组织量较大，且消化酶(如胶原酶、弹力酶)价格昂贵，因此实验成本较高;(2)酶作用时间不易掌握，消化作用容易受温度影响且消化酶本身对细胞有毒性作用，影响细胞贴壁;(3)操作复杂，污染机会较大。组织块培养法具有获得平滑肌细胞纯度高、量多、操作简单的优点，避免酶消化法的上述缺点[18]，而且本法取材量少，只需1只大鼠即可满足后续实验要求。但此法不足之处是原代培养周期长。一般实验用第3～8代VSMCs。
　　3.3改良组织块贴壁法培养VSMC的关键培养过程中可以有以下几点体会：(1)组织块培养的营养需求：笔者在原代培养时选用20%胎牛血清，传代培养采用10%的胎牛血清。(2)动物年龄的选择：选取的是体重为150 g的大鼠，因为年幼者的组织块有更好的增殖潜能，原代培养成活率高。(3)VSMCs分离方法的创新：分离中膜血管平滑肌时，本法采用的是用眼科弯镊反向牵拉去除外膜，同时用弯镊插入血管腔轻轻擦拭去除内膜，避免刀片刮内膜层引起中膜损伤，从而剥离内膜与外膜，大限度地减少内皮细胞和成纤维细胞的污染。(4)组织块的大小及摆放间距要适中，以保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀，剪成1mm3合适，并用吸管将组织块集中放入培养瓶的一角，间距0.1cm为佳。组织块不应剪切过小，否则组织块损伤大，水分容易丧失;组织块也不能剪的过大，否则不利于细胞从组织块中游出。另外，发现，剪血管块时将组织剪成多角形，会更利于细胞游离出。(5)注意事项：原代培养初期，当部分组织块漂浮未贴壁，可小心吸去培养基将其重新摆放至瓶底，直立干涸2～3h后，使其重新贴壁，再将培养瓶翻转平放，使组织块重新浸没于培养液中;传代时，细胞对新鲜配制的胰酶比较敏感，加入消化液37℃消化30s即消化充分，后续传代消化时间大约控制在2min内，在镜下观察到胞质回缩、间隙增大时立即终止消化。因此，本实验方法比较成熟，而且操作简单、经济，获得的细胞纯度高，是研究心血管疾病发病机制理想的细胞模型。(本文彩图见封三)

　　【参考文献】
　　1Cary LA, Guan J. Focal adhesion kinase integration-mediated signaling. Front Biosci, 1999,4:102-133.

　　2SM Schwartz, D deBlois,ER O′Brien. The intima. Soil for atherosclerosis and restenosis.Circ Res, 1995, 77 (3): 445-465.

　　3AC Newby,AB Zaltsman. Molecular mechanisms in intimal hyperplasia. J Pathol, 2000, 190(3): 300-309.

　　4Nakagawa M, Ohno T, Maruyama R, et al. Sesquiterpene lactone suppresses vascular smooth muscle cell proliferation and migration via inhibition of cell cycle progression. Biol Pharm Bull,2007, 30(9):1754-1757.

　　5Wang C, Zhang Y, Yang Q, et al. A novel cultured tissue model of rat aorta: VSMC proliferation mechanism in relationship to atherosclerosis. Exp Mol Pathol, 2007,83(3):453-458.

　　6Golovina VA, Blaustein MP. Preparation of primary cultured mesenteric artery smooth muscle cells for fluorescent imaging and physiological studies. Nat Protoc,2006, 1(6):2681-2687.

　　7徐正云，任国珍，马爱群. 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定. 岭南心血管病杂志，2005，11 (3)：202-204.

　　8李志刚，王章阳，刘松青. 大黄素对家兔离体主动脉平滑肌细胞增殖影响的可能途径. 中国临床康复，2005，9 (26): 134-135.

　　9Masood I, Porter KE, London NJ. Endothelin-1 is a mediator of intimal hyperplasia in organ culture of human saphenous vein . Br J Surg, 1997, 84 (4):499-503.

　　10Julia Kiyan , Angelika Kusch , Sergey Tkachuk, et al. Rosuvastatin regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in vascular remodeling: Role for the urokinase receptor. Atherosclerosis, 2007,195(2):254-261.

　　11Erik J Petersen, Toru Miyoshi, Zuobiao Yuan, et al. siRNA silencing reveals role of vascular cell adhesion molecule-1 in vascular smooth muscle cell migration. Atherosclerosis, 2008, 198 (2): 301-306.

　　12Murray CH Clarke, Nichola Figg, Janet J Maguire, et al. Apoptosis of vascular smooth muscle cells induces features of plaque vulnerability in atherosclerosis. Nature Medicine , 2006, 9(12): 1075-1080.

　　13Sun-Mi Won, Youn-Hee Park, Hee-Jung Kim, et al. Catechins inhibit angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell proliferation via mitogen-activated protein kinase pathway. Exp Mol Med, 2006, 38(5):525-534.

　　14Thormodsson FR, Olafsson IH. Isolation and culturing of human vascular smooth muscle cells. Methods Mol Biol，2005, 299:197-210.

　　15Szcs K, Lassègue B, Wenzel P，et al. Increased superoxide production in nitrate tolerance is associated with NAD(P)H oxidase and aldehyde dehydrogenase 2 downregulation. J Mol Cell Cardiol, 2007, 42(6):1111-1118.

　　16Rothman A, Kulik TJ.Taubman MB. Development and characterization of a cloned rat pulmonary arterial smooth muscle cell line that maintains differentiated properties through multiple subcultures. Circulation, 1992, 86(6):1977-1986.

　　17li[x]nksBond M, Chase AJ, Baker AH, et al. Inhibition of transc[x]ription factor NF-kappaB reduces matrix me[x]talloproteinase-1, -3 and -9 production by vascular smooth muscle cells. Cardiovasc Res, 2001, 50(3):556-565.

　　18马丽, 刘苏健, 邓勇志. 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定. 中国心血管病研究杂志, 2007, 5(5): 363-365.