E2F1在肾透明细胞癌中的表达及意义

       肾细胞癌(renal cell carcinoma)是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。其发病率仅次于膀胱癌,约占成人恶性肿瘤的2%~3%,起源于肾小管上皮细胞,其中60%~85%为透明细胞癌。肾透明细胞癌恶性程度高,且容易发生远处转移,在临床综合治疗方面对放化疗不敏感。
       目前疗效较好的有针对血管内皮生长因子(VEGF)的分子靶向治疗,但远期疗效不佳约。因此,探讨肾透明细胞癌发生和恶性进展机制对其早期诊断、早期治疗和评估预后等方面具有重要价值。细胞周期转录因子E2F1是E2F家族早被克隆的一员,调节细胞的增殖、分化、凋亡、死亡等。近年来研究发现E2F1表达水平及其活性变化与肿瘤的发生和恶性进展密切相关。有学者研究表明:E2Fl在乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤等不同类型肿瘤中的表达异常,但关于E2F1在肾透明细胞癌中的表达目前尚无报道。本文主要研究E2Fl在肾透明细胞癌组织和对应瘤旁组织中的表达情况,对的mRNA相对表达量和临床病理资料进行相关分析,并探讨它在肾透明细胞癌发生和恶性进展中的作用。 
       1资料与方法 
       1.1临床资料

       52例肾透明细胞癌及其对应瘤旁组织标本均来自于解放军总医院泌尿外科2009年1~3月手术标本。标本采集后立即以液氮进行快速冷冻并保存在-80C冰箱中。病例标本的=般资料、临床病理资料见表1。 
       1.2研究方法

       总RNA提取及实时定量PCR:采用总RNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司),按试剂说明书抽提组织总RNA。提取后经Nan。Drop 1000Spectrophotometer测定其纯度和浓度,A260/A280比值在1,8~2,0。然后逆转录合成cDNA,试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司(Transsc[x]ript First—Strand cDNA Synthesis Super Mix)。实时定量PCR使用SYBR Grecn染料法(北京全式金生物技术有限公司)。E2F1引物序列为:上游5'CAGAGCAGATGoTTATGG3',下游5'—CTGAAAGTTCTCCGAAGA3';内参PPIA的引物序列为:上游5LATGGTCAACCCCACCGT-GT-3'下游5LTCTGCTGTCTTTGGGACCTT—GTC3'。通过琼脂糖凝胶电泳确定产物的特异性,每个样品行3次重复,后采用2—△△CT法进行相对定量。蛋白提取及Western blot:采用RIPA蛋白裂解液试剂盒分别提取细胞和组织总蛋白,按BCA法(北京艾德莱生物科技有限公司)测定蛋白浓度。按总蛋白50ug/L(20ul)加样,组织蛋白样品准各好后按照Western blot标准流程操作。E2F1抗体购自美国ABcam公司,工作滴度为1:1O00;二抗购自北京中杉金桥公司,为1:3000浓度稀释的羊抗兔抗体;内参GAPDH为北京中杉金桥公司分装抗体,二抗也来自于中杉金桥公司(1:3000)。之后用SuperECL Plus超敏发光液(北京普利莱公司)显影于X线片,每个样品行3次重复。 
       1.3统计学处理采用SPSS18.0统计软件,相对mRNA表达水平以均数±标准差(T±s)表示。采用莎检验比较组间差异,多组数据比较采用单因素方差分析及SNKq检验。采用直线相关分析基因mRNA表达水平和临床病理资料的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。 
       2结果

       2.1E2F1在肾透明细胞癌及相应瘤旁组织中的表达采用实时定量PCR检测Ⅱ对肾透明细胞癌组织及瘤旁组织的mRNA表达。如图1A所示,肿瘤组E⒉F1mRNA水平明显高于对应瘤旁组(P=0.0002),Western blot实验显示肿瘤组E2F1的蛋白水平也高于瘤旁组(图1B)。 
       2.2E2F1的mRNA水平与临床病理资料的关系E2F1mRNA水平在不同年龄(P=0,241)、性另刂(P=0,144)组间的表达差异无统计学意义,在组织学分级(P=0,002)、肿瘤直径大小(P<0.001)、T分期(P=0.003)、临床分期(P=0.002)以及大血管(肾静脉和下腔静脉)浸润与否(P(0,001)组间差异有明显的统计学意义。肿瘤组织E2F1mRNA表达水平在组织学分级(r=-o.470,P(0.001)、肿瘤直径大小(r=o.狃3,P=0。001)、T分期('=-0。455,P=0.001)、临床分期(r=—0.467,P<0.001)以及大血管(肾静脉和下腔静脉)浸润与否(r=-o.475,P(0,O01)各组中呈显著直线相关性(表1)。 
       3讨论

       转录因子E2F1是E2F家族一员,能诱导细胞快速进人S期,是细胞周期网络中的关键环节,在调控细胞增殖中处于核心地位。E2F家族成员能结合人类约7%基因的启动子,从而调控这些基因的转录和表达,参与很多生命进程和疾病形成,细胞损伤修复,诱导细胞凋亡、增殖和细胞死亡等。近年来有学者研究发现E2F1在肿瘤发生发展中发挥重要作用,某些肿瘤组织中E2F1表达水平下调,如乳腺癌、恶性胶质瘤等,而某些肿瘤组织中E2F1表达水平上调,如食管腺癌、黑色素瘤等。 
       综上所述,E2F1基因在不同的肿瘤中表达水平不一致,甚至趋势相反。作为上游的转录因子,E2F1在不同肿瘤的发生和恶性发展过程中扮演着不同的角色,可能是E2F1在不同的肿瘤组织类型中与下游结合不同的靶基因,寻致不同的肿瘤转归。shi等发现,在乳腺癌中,肿瘤恶性程度越高,E2F1的表达水平也越高,E2F1与乳腺癌预后分子指标之间也有很强的关联性Ⅱ。

       在膀胱癌研究中,E2F1的表达上调能够预测非肌层浸润性膀胱癌进展至肌层浸润性膀胱癌的危险度。肾透明细胞癌作为泌尿系常见的肿瘤之一,目前缺乏早期诊断的分子指标,恶性程度高,易发生远处转移。本研究分别从mRNA水平以及蛋白水平检测了E2F1在肾透明细胞癌组织和对应瘤旁组织中的表达情况,证实了E2F1在肾透明细胞癌中的表达是升高的(mRNA表达差异P=0,0002,对应的蛋白水平组间差异也是一致的)。
       综上所述,本研究证实了E2F1在肾透明细胞癌中的表达是升高的,并且E2F1的高表达与肾癌的恶性程度相关,E2F1表达越高,肿瘤病理组织学分化程度越低(P=0.0O2),肿瘤直径越大(P(0,001),T分期越高(P=0.003),临床分期越高(P=0,002)以及大血管(肾静脉和下腔静脉)浸润可能性越大(P<0.001)。有文献报道,E2F1能够驱使静止期或生长受阻的细胞通过邛艮制点进人到S期,从而促进细胞增殖。因此,E2F1的表达与肿瘤大小、分期、临床分期有很高的相关性。在肿瘤的侵袭力方面,有研究表明:在非小细胞肺癌中,E2F1能够启动下游基质金属蛋白酶9、14、15(MMP9,MMP14,MM15)的转录和激活,促进肿瘤的恶性进展,并且与血管浸润有关。 
       综上所述,在肾透明细胞癌的发生和恶性发展中可能起到原癌基因的作用,为探讨肾癌发病机制和新的靶向治疗提供了新的探索思路。对于E2F1在肾癌中表达变化的原因和如何促进肾癌发生发展的机制,以及寻找下游结合的靶基因,我们将在后续研究中作进一步探讨。