腹腔CEA mRNA检测在胃癌穿孔治疗中的意义

作者：宋晓斌,董强,侯波,赵金伟,饶艳伟　　作者单位：吉林省人民医院，吉林 长春 130021

　　【关键词】 胃癌穿孔;CEA mRNA;综合治疗

　　胃癌穿孔是进展期胃癌的严重并发症之一，多发生于老年患者，在胃癌中的发生率为0.49%～3.64%〔1〕。胃癌穿孔患者往往全身情况差、高龄、腹腔污染较重，且脱落的癌细胞易发生腹腔内种植，然而针对胃癌穿孔病例是否该行性手术尚有争议。复发与转移是胃癌治疗失败和死亡的主要原因，因此监测肿瘤转移以判断预后在指导胃癌穿孔的治疗中具有重要意义。目前研究认为相对于腹腔脱落细胞学检查，采用RTPCR法检测癌胚抗原(CEA)mRNA是检测腹腔游离癌细胞的敏感指标，可以作为胃癌患者腹膜转移情况及预后判断的良好指标，并对治疗有指导意义。本研究探讨癌胚抗原(CEA)分子生物学检测技术对比研究肿瘤细胞在其腹水和腹膜中的分布特点及随访结果，以期为胃癌穿孔治疗提供依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 临床资料

　　2003年6月至2008年9月本院行性手术的38例进展期胃癌患者及18例胃癌穿孔患者。进展期胃癌组患者年龄为38～85(平均52)岁，其中60岁以上占60.53%;胃癌穿孔组患者年龄为45～72(平均66)岁，60岁以上占83.33%，均在12 h内行手术治疗。术中发现进展期胃癌组有肝转移2例、横结肠转移1例，胃癌穿孔组肝左叶转移1例，均联合脏器切除。两组患者各有2例发现肉眼下腹膜种植灶，予以局部切除。其余进展期胃癌组病例均行D2切除，胃癌穿孔组11例行D1切除，6例行D2切除。关腹前视术中情况用低渗温盐水4 000～10 000 ml分4～10次反复冲洗腹腔。术后TNM分期：进展期胃癌组Ⅱ期15例、Ⅲ期18例、Ⅳ期5例;胃癌穿孔组Ⅱ期3例，Ⅲ期12例，Ⅳ期3例。两组患者中CEA mRNA阳性者均术后1 w开始腹腔化疗，将国产顺铂(DDP)100 mg、5Fu 750 mg、庆大霉素24万U，溶于1 000 ml生理盐水中，经腹腔于左或右中腹穿刺灌入，连续3 d，间隔1个月重复进行，连续3个疗程;所有患者术后均给予常规静脉化疗，均在生存期内接受随访，定期复查腹部影像学检查，以明确肿瘤的转移复发情况并分析术后生存率。
　　1.2 腹水细胞学检查
　　涂片后行HE染色，进行细胞学检查。
　　1.3 腹水及腹膜CEA mRNA的检测
　　1.3.1 标本的收集、处理和保存

　　开腹后，如有腹水则直接吸出，如无腹水则于Douglas窝或左膈下置入导尿管，注入200 ml无菌生理盐水，在不触动原发灶的情况下，轻轻搅动后吸出100 ml，所有标本离心后沉渣，一半涂片，另一半贮存于-80℃冰箱保存备用。如有腹膜转移病灶则予部分切除，否则切除少量大网膜、盆腔腹膜和膈腹膜，用生理盐水反复冲洗后也置于-80℃冰箱保存备用。
　　1.3.2 RTPCR法检测CEA mRNA水平

　　Trizol试剂、逆转录及PCR试剂盒均为Takara公司产品。GenBank 获取人CEA及 GADPH 基因序列，应用premier 5.0 软件设计引物，由大连宝生物公司合成。 CEA引物：5′CATGATTGGAGTGCTGGTTG3′，5′AGAGATGGGGTTTCACGATA3′，197 bp，退火温度58℃;GAPDH引物：5′GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3′，5′AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC3′，617 bp，退火温度55℃。
　　1.4 统计学处理
　　采用SPSS11.0软件包进行χ2检验。
　　2 结 果
　　2.1 两组腹腔细胞学及分子生物学检查肿瘤细胞阳性率的比较
　　进展期胃癌组腹腔液和腹膜组织中CEA mRNA阳性率分别为39.47%(15/38)和44.74%(17/38)，均高于腹腔液细胞学阳性率〔28.95%(11/38)〕，可见RTPCR法敏感性高于细胞学检查。胃癌穿孔组腹膜CEA mRNA阳性率〔50.00%(9/18)〕要高于进展期胃癌组，但差异不显著;其腹水细胞学〔88.33%(16/18)〕和CEA mRNA检查阳性率〔88.33%(16/18)〕一致(其中7例腹膜CEA mRNA检查阴性)，不但显著高于进展期胃癌组，而且高于同组腹膜CEA mRNA阳性率(均P<0.05)。另外，两组病例发现肉眼下腹膜种植灶患者的腹膜转移病灶、腹水或冲洗液中细胞学和CEA mRNA均阳性。
　　2.2 两组患者术后2年无瘤存活率的比较
　　进展期胃癌组的无瘤存活率〔55.26%(21/38)〕要高于胃癌穿孔组〔50.00%(9/18)〕，但差异不显著;术后肿瘤转移率〔36.84%(14/38)〕及死亡率〔7.89%(3/38)〕与胃癌穿孔组〔36.84%(14/18)、11.11%(2/18)〕也无明显差别。
　　3 讨 论
　　患者年龄偏大、一般情况差、溃疡及穿孔直径大，病理恶性度高〔2〕等为胃癌穿孔的特点。患者常伴多种并发症，加之营养不良、低蛋白血症和免疫功能抑制等，穿孔后腹膜炎病情发展迅速、危重而复杂，同时，大量肿瘤细胞随消化液进入腹腔，发生腹膜种植和转移概率大大增加。CEA是消化道肿瘤可靠的肿瘤标记物之一，Ohtsuka〔3〕等研究发现以血清CEA水平检测的特异性及敏感性不高。而Jung〔4〕对119例伴有腹水的癌症扩散胃癌患者的腹水细胞学、血清及腹水中CEA的水平回顾性研究表明，腹水CEA平均值明显高于血清，认为腹水CEA水平可以作为伴有腹水的进展期胃癌患者预后判断的一个标志物。目前，以RTPCR法检测腹腔冲洗液CEA mRNA靶基因的表达，因其高敏感性及高特异性，被认为是检测腹腔脱落癌细胞的有效方法。
　　本研究结果显示进展期胃癌患者腹水CEA mRNA的阳性率明显高于细胞学检查，可以作为检测肿瘤细胞的良好指标。而胃癌穿孔组二者阳性率一致，且均明显高于非穿孔组，考虑与胃癌穿孔过程中大量肿瘤细胞进入腹腔有关，而细胞学检查阳性率的提高可能与腹腔内肿瘤细胞数量的增加有关。研究表明，由于腹膜的解剖特点和生理倾向性，腹膜转移多早出现在大网膜、膈和盆腔腹膜处，如这些部位检测出CEA mRNA表达，则说明已发生腹膜微转移〔5,6〕。可见腹膜CEA mRNA的检测对监测肿瘤转移非常有意义。本研究胃癌穿孔组有7例腹膜并未检测出CEA mRNA表达，但腹腔液细胞学检查和CEA mRNA均为阳性;分析原因如下：①并不一定腹腔内所有的游离癌细胞均发生腹膜种植，胃穿孔后可引起腹腔剧烈的炎症反应，白细胞及大量炎症介质聚集，腹腔内环境的改变影响了肿瘤细胞的着床种植;②我们选择的胃癌穿孔病例均在12 h内手术，穿孔时间短，游离肿瘤细胞尚未发生腹膜种植;③取材选择部位不同造成的假阴性率。
　　有关胃癌穿孔的治疗，以往认为其预后较差，很少行术。近年来，国内外学者逐渐持积极态度，主张只要患者一般状态可以耐受手术，应尽可能行一期性胃切除并行的淋巴结清扫〔7〕。Kasakura等〔8〕认为,胃癌穿孔性切除的疗效要好于胃癌姑息性切除,且对早期癌的疗效更佳。以上观点同我们的随访结果亦相吻合。本研究显示穿孔组的腹水细胞学和CEA mRNA检查的阳性率均明显高于胃癌进展组，因此在行性手术的同时，如何避免胃癌穿孔后腹腔游离的肿瘤细胞发生腹膜种植和转移，成为手术成败的关键。Nieuwenhuis等〔9〕对5例有浆膜层浸润的胃癌患者进行术间多次腹腔冲洗,以RTPCR检测结果判断腹腔冲洗液游离癌细胞数量，结果经过7～10次冲洗后腹腔游离癌细胞的数量几乎为0，说明术中有效的腹腔冲洗可以明显减少腹腔游离的肿瘤细胞，从而降低腹膜种植和转移概率。近年来国内外均有学者报道术中、术后早期腹腔化疗、腹腔温热化疗等以减灭腹腔残余癌细胞为目的的方法、技术，认为术后早期肿瘤细胞正处于快速增殖期，细胞群倍增时间短，增殖比例大，对细胞周期性特异性药物敏感，因而化疗药物更易杀死腹腔内微小转移灶及播散的癌细胞。结合本实验结果，我们认为腹膜种植是胃癌穿孔患者术后复发和转移的重要途径，因此在行一期性手术治疗的同时，一定要重视术中充分腹腔冲洗、术中及术后早期腹腔化疗技术等综合性治疗手段的应用，通过以上手段减灭腹腔残余肿瘤细胞，达到延长患者存活期甚至治愈的目标。
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