慢性阻塞性肺疾病患者支气管黏膜活检标本中HO-1和iNOS

　　作者：李巧荣,吴大玮,杨蕾1,韩进2　　　作者单位：1 山东省胸科医院呼吸科 2 烟台市烟台山医院呼吸科 (山东大学齐鲁医院加强医疗科，山东 济南 250012)

　　【摘要】目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者支气管黏膜血红素氧化酶-1(HO-1)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的表达及其与肺功能的关系。方法 28例因肺癌行支气管镜检查的患者，根据是否吸烟及肺功能检查分为三组：(1)吸烟伴COPD组9例;(2)吸烟肺功能正常组9例;(3)不吸烟肺功能正常组10例，经电子支气管镜钳取支气管黏膜，用免疫组化法检测支气管黏膜中HO-1和iNOS的表达，并与肺功能结果进行相关性分析。结果 吸烟伴COPD组支气管黏膜中HO-1和iNOS的表达(0.156±0.036，0.188±0.030)较不吸烟肺功能正常组(0.094±0.043，0.159±0.034)明显增强，差异有统计学意义(P<0.01);吸烟伴COPD组和吸烟肺功能正常组(0.147±0.049 vs 0.176±0.053)之间没有统计学差异(P>0.05)。气管黏膜中HO-1和iNOS的表达无相关性(r=0.046，P>0.05)。气管黏膜中HO-1的表达与FEV1呈负相关(r=-0.558，P <0.05)。结论 COPD患者气管黏膜中HO-1和iNOS的表达增强，并且与FEV1呈负相关。
　　【关键词】 慢性阻塞性肺疾病;支气管黏膜;血红素氧化酶-1; 诱生型一氧化氮合酶;免疫组织化学

　　氧化应激反应在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)的发病过程中起到重要作用〔1〕。炎症和氧化应激可以刺激细胞内血红素氧化酶-1(HO-1)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的表达〔2〕。HO-1的降解产物具有抗氧化活性，HO-1还可直接上调细胞外过氧化物歧化酶(ecSOD)表达，从而对肺脏有保护功能〔3，4〕;而iNOS可产生过高的NO,使细胞的氧化还原电位转向更强的氧化状态;同时，NO与烟草中的超氧阴离子反应生成过氧亚硝酸离子和过氧亚硝酸盐，前者为强氧化剂,后者有细胞毒作用〔5〕。目前对于不同严重程度、稳定期或急性加重期COPD患者肺组织HO-1表达水平升高或降低仍有争议〔6，7〕，研究方法也主要是通过诱导痰、支气管肺泡灌洗液、手术切除标本进行〔6~8〕，对于活体支气管黏膜标本进行研究的报道少见。因此，本文经支气管镜钳取COPD患者支气管黏膜，观察HO-1和iNOS的表达变化。
　　1 材料与方法
　　1.1 病例选择

　　在山东大学齐鲁医院门诊或病房因肺部占位病变行支气管镜检查的患者28例，根据是否吸烟和肺功能检查结果将其分为3组：(1)吸烟伴COPD组9例，(2)吸烟肺功能正常组9例(FEV1≥70%预计值);(3)不吸烟肺功能正常组10例。各组研究对象临床指标见表1。吸烟两组之间的吸烟指数及三组患者在FEV1、年龄和性别方面的比较均无统计学差异。所有入选的COPD患者均为稳定期，符合中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》中的诊断标准〔9〕。所有患者在术前3~5 d内均进行了CT检查、常规肺功能检查和支气管舒张试验，排除肺间质纤维化、支气管扩张等其他影响肺功能的疾病。电子支气管镜黏膜活检时间均在上午8：00～10：00。
　　1.2 黏膜取材

　　术前10～12 h禁食，术前15 min雾化吸入2%利多卡因行气道麻醉。仰卧位，给予鼻塞吸氧和心电监护，支气管镜通过鼻腔进入气道，用活检钳取肺肿块对侧(健侧)肺上/下叶(中间)、中/下叶支气管间脊黏膜。活检组织立刻放入多聚甲醛中固定、梯度酒精脱水、透明后石蜡包埋，做2 μm厚切片备免疫组化用。
　　1.3 免疫组化染色

　　用抗生素蛋白-生物素-过氧化物酶(ABC)法行细胞因子免疫组化染色，HO-1和iNOS为兔抗人多克隆抗体(购自北京中山生物技术有限公司)，HO-1为即用型、iNOS为浓缩型(所用浓度为1∶200)。将石蜡切片烘烤脱蜡至水，0.01 mmol/L枸橼酸钠高压10 min，进行抗原修复，室温冷却后3%过氧化氢浸泡10 min，10%山羊血清封闭15 min，然后加一抗4℃过夜，加二抗，37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，树胶封片。HO-1和iNOS均在胞质中表达，在显微镜400倍下用全自动图像分析系统对阳性染色进行分析，测定两者的平均吸光度值，随机测定4个高倍视野后计算平均值，作为该切片的代表值。
　　1.4 统计学分析
　　用SPSS11.5统计软件进行数据处理，所有数据以x±s表示。各组免疫组化结果之间的比较采用两样本均数t检验。HO-1和iNOS及与FEV1的相关性采用Pearson相关分析。
　　2 结 果
　　2.1 免疫组化染色结果

　　2.1.1 HO-1的表达
　　HO-1在吸烟伴COPD组患者气管黏膜的上皮细胞、巨噬细胞均呈强阳性表达，吸烟肺功能正常组表达增强，不吸烟肺功能正常组弱表达。见图1。HO-1在吸烟伴COPD组(0.156±0.036)和吸烟肺功能正常组(0.147±0.049)的表达均明显高于不吸烟肺功能正常组(0.094±0.043)(P<0.01)，吸烟两组无统计学差异(P>0.05)。表1 研究对象临床资料图1 各组HO-1和iNOS的免疫组化染色(DAB，×400)

　　2.1.2 iNOS的表达
　　iNOS在吸烟伴COPD组气管黏膜上皮细胞和巨噬细胞呈强阳性表达，在吸烟肺功能正常组呈阳性表达，在不吸烟肺功能正常组呈弱阳性表达。见图1。iNOS在吸烟伴COPD组的表达(0.188±0.030)明显高于不吸烟肺功能正常组(0.159±0.034,P<0.01)，吸烟肺功能正常组(0.176±0.053)虽然高于不吸烟肺功能正常组(0.159±0.034)，但两者之间无统计学差异(P>0.05)。
　　2.2 HO-1与iNOS的表达与肺功能的关系

　　气管黏膜HO-1与iNOS的表达无明显的相关性(r=0.046，P>0.05)，HO-1在气管黏膜中平均吸光度值与FEV1呈负相关(r=-0.558,P<0.05)。见图2。图2 HO-1平均吸光度值与FEV1的相关性
　　3 讨 论
　　HO是一种可诱导的抗氧化酶，目前发现有3种同工酶，包括诱导型HO-1、结构型HO-2和HO-3〔10〕。目前发现HO-2的表达和活性不受氧化应激等诱导，HO-3缺乏活性，其生物学特性和功能尚不清楚，而HO-1是迄今为止发现的生物体内容易被诱导产生的抗氧化酶。HO-1可以催化含铁血红素产生胆红素、铁蛋白和一氧化碳。研究发现胆红素是一种有效的抗氧化剂，体外实验证实胆红素能清除氧自由基，一氧化碳对炎症细胞或外源性氧化剂产生的氧自由基导致的肺损伤有保护作用〔11〕。
　　近年的研究还进一步发现，HO-1 对于COPD发病的多个病理和病理生理环节均有保护作用。Shinohara〔12〕的动物实验证明，腺病毒转基因小鼠肺组织HO-1高表达可减低肺泡灌洗液中性粒细胞、TNF-α、IL-6和胶质细胞源性趋化因子水平，升高抗炎性因子Il-10水平，并减轻弹性蛋白酶导致的肺气肿程度;Lee等〔13〕在人气道平滑肌细胞体外培养中加入HO-1诱导剂钴原卟啉(cobalt protoporphyrin )，或用携带人HO-1基因的重组腺病毒感染平滑肌细胞，高表达的HO-1通过下调氧化应激反应、黏附分子和IL-6减轻了TNF-α介导的气道炎症,抑制了TNF-α诱导的NF-κB活性，以及TNFR1/c-Src/p47phox复合物的形成;HO-1可诱导牛肺动脉(BPA)细胞外过氧化物酶(ecSOD)表达增加，从而减轻低氧性肺血管收缩(HPV)〔3〕; Almolki等〔14〕报道HO-1可抑制香烟暴露导致的气道黏液高分泌。
　　尽管HO-1作为炎症和氧化应激的可诱导酶，但是，关于临床COPD患者肺和气道组织HO-1表达水平是升高抑或是降低报道结果不一。大部分研究〔6，8〕认为在COPD患者肺和气道组织中HO-1表达增加，但也有部分作者报道HO-1在COPD手术切除标本中表达降低〔7〕。本文通过支气管活检标本的研究表明，吸烟伴COPD组和吸烟肺功能正常组气管黏膜中HO-1的表达均较不吸烟肺功能正常组增高，表明吸烟是诱导气道黏膜组织高表达HO-1的重要原因。
　　以往少有肺功能与HO-1表达水平之间关系的报道。本研究发现，支气管黏膜中HO-1的表达水平与FEV1呈负相关，提示随着COPD程度加重，气道黏膜HO-1表达增加。Hogg等〔15〕曾报道，随着COPD患者GOLD分级增加，气道黏膜浸润的巨噬细胞和嗜中性粒细胞数也相应增加。根据生理学规律，随着炎症程度加重，其诱导HO-1表达的水平也可能随之增高;但是，HO-1的抗氧化功能并不足以对抗炎症加重或长期病程对气道的氧化损伤作用〔6〕。曾有报道，在严重COPD病人肺泡巨噬细胞内HO-1表达减少，认为存在HO-1基因多态性现象，使部分患者对氧化损伤的防御机制降低〔16〕。
　　iNOS主要由巨噬细胞产生，可以催化L-精氨酸生成一氧化氮(NO)，过高的NO可以造成组织细胞的氧化损伤〔5，17〕，活化基质金属蛋白酶，促进肺气肿的产生〔18〕。目前研究已经证明，COPD患者诱导痰液iNOS的表达升高，呼出气中的NO含量增加〔19〕。本研究也表明，COPD病人气管黏膜中iNOS的表达增强。但是，吸烟肺功能正常组iNOS的表达尽管较不吸烟肺功能正常组增高，但无统计学差异。这在一定程度上提示，iNOS在COPD病人黏膜内表达增高可能不单纯是由于吸烟引起的，吸烟导致肺脏的炎症程度与黏膜内iNOS表达之间的关系尚需要进一步的研究。
　　氧化/抗氧化机制的相互制约是一个复杂的过程。氧化应激可活化上皮细胞和炎症细胞内的转录因子，使编码HO-1和iNOS的基因表达上调〔18〕。HO-1可以通过降解血红素下调iNOS的表达，而NO有稳定HO-1信使核糖核酸的作用，从而可以上调HO-1的表达〔20〕。本实验研究结果显示COPD患者支气管黏膜中HO-1和iNOS表达无明显相关性，不能确定这是否与本试验对象多为轻、中度COPD病例有关，也不清楚重度COPD病例支气管黏膜中两者之间的相关关系。
　　本研究结果表明，气道黏膜HO-1表达与气流受限程度正相关，这在一定程度上提示炎症和氧化应激诱导的抗氧化保护机制是不充分的，进一步探索可用于临床的强效HO-1活化剂可能是COPD治疗研究的一个潜在方向。
　　【参考文献】
　　[1] Global Strategy for Diagnosis，Management，and Prevention of COPD〔J〕. Updated December，2009.

　　[2] Wedzicha JA.Exacerbations：etiology and pathophysiologic mechanisms〔J〕.Chest，2002;121(suppl)：136S-41S.

　　[3] Ahmad M，Zhao XM，Kelly MR,et al.Heme oxygenase-1 induction modulates hypoxic pulmonary vasoconstriction through upregulation of ecSOD〔J〕. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009;297(4)：H1453 -61.

　　[4] Morse D，Choi AM.Heme oxygenase-1：the “emerging molecule” has arrived〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol，2002;27:8-16.

　　[5] Kroncke KD，Fehsel K，Suschek C，et al.Inducible nitric oxide synthase-derived nitric oxide in gene regulation，cell death and cell survival〔J〕. Int Immunopharmacol，2001;1:1407-20.

　　[6] Maria Tsoumakidou，Nikolaos Tzanakis，Georgios Chrysofakis,et al.　Nitrosative stress，heme oxygenase-1 ex[x]pression and airway inflammation during severe exacerbations of COPD〔J〕.Chest，2005;127:1911-8.

　　[7] Maestrelli P，Paska C，Saetta M,et al.Decreased haem oxygenase-1 and increased inducible nitric oxide synthase in the lung of severe COPD patients〔J〕.Eur Respir J，2003;21:971-6.

　　[8] Maestrelli P，El Messlemani AH，De Fina O,et al.Increased ex[x]pression of heme oxygenase (HO)-1 in alveolar spaces and HO-2 in alveolar walls of smokers〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2001;164:1508-13.

　　[9] 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2002;25:453-60.

　　[10] Otterbein LE，Choi AM.Heme oxygenase：colors of defense against cellular stress〔J〕.Am J Physiol，2000;279：L1029-37.

　　[11] Otterbein LE，Mantell LL，Augustine MK.Carbon monoxide provides protection against hyperoxic lung injury〔J〕.Am J Physiol，1999;276:L688-94.

　　[12] Shinohara T，Kaneko T，Nagashima Y,et al.Adenovirus-mediated transfer and overex[x]pression of heme oxygenase 1 cDNA in lungs attenuates elastase-induced pulmonary emphysema in mice〔J〕.Hum Gene Ther，2005;16(3):318-27.

　　[13] Lee IT，Luo SF，Lee CW,et al.Overex[x]pression of HO-1 protects against TNF-{alpha}-mediated airway inflammation by down-regulation of TNF R1-dependent oxidative stress〔J〕.Am J Pathol，2009;175(2)：519-32.

　　[14] Almolki A，Guenegou A，Golda S,et al.Heme oxygenase-1 prevents airway mucus hypersecretion induced by cigarette smoke in rodents and humans〔J〕.Am J Pathol，2008;173(4)：981-92.

　　[15] Hogg JC，Chu F，Utokaparch S,et al.The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.N Engl J Med，2004;350:2645-53.

　　[16] Rahman I，Biswas SK，Kode A.Oxidant and antioxidant balance in the airways and airway diseases〔J〕.Eur J Pharmacol，2006;533:222-339.

　　[17] Murata M，Kawanishi S.Oxidative DNA damage induced by nitrotyrosine，a biomarker of inflammation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2004;316:123-8.

　　[18] Ricciardolo FL，Caramori G，Ito K,et al.Nitrosative stress in the bronchina mucosa of severe chronic obstructive pulmonary disease〔J〕. Allergy Clin Immunol，2005;116:1028-35.

　　[19] Rutgers SR，Mark TW，Coers W,et al.Markers of nitric oxide me[x]tabolism in sputum and exhaled air are not increased in chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Thorax，1999;54:576-80.

　　[20] Maestrelli P，Paska C，Saettta M,et al.Decreased heme oxygenase-1 and increased inducible nitric oxide synthase in the lung of severe COPD patients〔J〕.Eur Respir J,2003;21:971-6.