多用途基因捕获C3H/10T1/2细胞阳性克隆库的构建及鉴定

　作者：王明科,邹仲敏,罗成基,粟永萍　　作者单位：第三军医大学军事预防医学院放射医学教研室,全军复合伤研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400038

　　【摘要】 目的： 以10T1/2细胞为间充质干细胞模型，构建用于间充质干细胞分化及恶性转化分子机制等研究的基因捕获阳性克隆库. 方法： Dra I线性化逆转录病毒基因捕获载体ROSAFARY后，与pIRES2-EGFP用脂质体共转染phoenix细胞，LacZ染色证明转染成功后收集病毒上清感染10T1/2细胞. 经潮霉素筛选获得阳性克隆，为排除假阳性克隆用LacZ部分片段PCR进行鉴定. 结果： ROSAFARY脂质体转染phoenix细胞后48 h，GFP指示的转染效率约为20%～30%，LacZ染色有大约10%的阳性率. 150 mg/L潮霉素筛选病毒感染的10T1/2细胞，挑取药物抗性克隆，PCR鉴定后获得43个阳性克隆，LacZ染色5个为捕获基因高表达细胞克隆. 结论： 基因捕获技术建立非胚胎干细胞的克隆是可行的，成功建立的基因捕获阳性克隆库为应用基因捕获技术揭示成体干细胞分化及恶性转化分子机制奠定了基础.

　　【关键词】 基因捕获 C3H/10T1/2细胞 聚合酶链反应R β-半乳糖苷酶类

　　Establishment and identification of gene trap clones from C3H/10T1/2 cells transfected with rosafary vector

　　WANG Ming-Ke,ZOU Zhong-Min,LUO Cheng-Ji,SU Yong-Ping

　　Department of Radiation Medicine,State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,Institute of Combined Injury,College of Preventive Medicine,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China

　　【Abstract】 AIM： To construct a library of gene trapped clones ba[x]sed on rosafary-transfected C3H/10T1/2 cell line in order to provide a new platform for study of the mechanism of differentiation or malignant transformation of mesenchymal stem cells. METHODS： Retroviral gene-trap vector,ROSAFARY,was linearized with Dra I and co-transfected with pIRES2-EGFP into packaging cell line phoenix by Lipofectamine. The retrovirus particles containing gene-trap construct were collected to infect 10T1/2 cells and LacZ staining was used to prove the result of transfection. Genomic PCR targeting LacZ sequences in ROSAFARY vector were performed to further identify the drug-resistant 10T1/2 clones. RESULTS： At 48 h after the transfection,GFP co-transfection indicated that the transfection efficiency reached 20%～30% and about 10% of positive LacZ staining was achieved in packaging cells. By hygromycin selection with the concentration of 150 mg/L,total 43 clones were confirmed by PCR,including 5 clones with positive LacZ staining,which indicated the active promoter activity of trapped gene. CONCLUSION： It is feasible to construct a library of gene trapped clones by gene trap technique in cells other than embryonic stem cells and the library provids a new platform for screening genes related with adult stem cell differentiation and malignant transformation.

　　【Keywords】 gene trap; C3H/10T1/2 cells; polymerase chain reaction;beta-galactosidase

　　0 引言

　　干细胞由于具有高度自我更新和多向分化潜能的优势成为近年基础及临床研究的热点，但其向某一特定途径分化，形成特定类型组织细胞及发生恶性转化的机制至今仍不清楚. 如何确认干细胞分化及恶性转化机制，既需要实验结果的积累，更需要技术方法的突破. 基因捕获是一种简便而高效的解析基因功能的新方法. 该方法通过随机插入突变后报告基因的表达揭示突变内源基因的功能[1]. C3H10T1/2细胞(简称10T1/2细胞)是Reznikoff等[2]从C3H小鼠分离建立的间充质干细胞株，可分化为骨[3]、软骨[4]、脂肪[5]、肌[6]和内皮细胞[7]，射线和化学诱导剂可使其恶性转化. 本实验将10T1/2细胞作为间充质干细胞模型，用LacZ为报告基因的PolyA基因捕获载体ROSAFARY转染10T1/2细胞，建立为应用基因捕获技术研究间充质干细胞分化及恶性转化分子机制的基因捕获阳性克隆库.

　　1 材料和方法
　　1.1 材料 大肠杆菌E. coli. DH5α，质粒pIRES2-EGFP由本所保存. RV包装细胞phoenix由本校生化教研室惠赠. 10T1/2细胞购自ATCC细胞库. 基因捕获载体ROSAFARY由Soriano博士惠赠(Fred Hutchinson Cancer Research Center,Seattle,Washington,USA). Hind Ⅲ和Dra I为New England Biolabs公司产品. 质粒提取试剂盒为Omega公司产品. DMEM高糖培养基为Gibco公司产品，小牛血清(FCS)购自兰州民海生物工程有限公司. 潮霉素购自京科宏达公司. Lipofectamine 2000为Invitrogen 公司产品. LacZ染色试剂盒为Activemotif公司产品. 聚凝胺(polybrene)购自Chemicon公司. 蛋白酶K为Merck公司产品. PCR引物由上海英俊公司合成，Taq聚合酶为Takara公司产品. 二甲基亚砜(DMSO)购自成都科龙化工厂.

　　1.2 方法

　　1.2.1 捕获载体ROSAFARY的鉴定及线性化 载体ROSAFARY按常规方法电转化DH5 α菌后在含氨苄青霉素的LB平板上过夜培养16 h，挑单克隆摇菌提取质粒. 用Hind Ⅲ单酶切和Dra I单酶切电泳鉴定. 鉴定正确后，取ROSAFARY 80 μL，Dra I酶8 μL，Dra I酶缓冲液12 μL混匀，37 ℃保温1 h，取1 μL酶切液电泳以确定ROSAFARY是否被完全线性化. 之后加入2倍体积的无水乙醇-70 ℃沉淀3 h，4 ℃离心7 500 g×10 min，弃上清，以700 mL/L乙醇8700 g ×5 min洗涤2次，超净台上干燥. 加入30 μL去离子水使之溶解，以50 μL去离子水为对照测A260nm值后-70 ℃保存.

　　1.2.2 潮霉素对10T1/2细胞的毒性实验 10T1/2细胞以1×105/孔接种于24孔板，细胞贴壁后加入不同浓度的选择剂潮霉素(0，25，50，100，150，200，300，400，600，800 mg/L)，并作复孔. 2 d换液1次，连续观察14 d.

　　1.2.3 ROSAFARY的转染 收获生长状态良好的phoenix包装细胞重悬于DMEM培养基，以9×105/孔接种于6孔板，置37℃，50 mL/LCO2培养箱培养18～24 h，待细胞贴壁生长达90%融合时，以Lipofectamine2000介导线性化的ROSAFARY和pIRES2-EGFP共转染：4.5 μg/孔ROSAFARY、0.2 μg/孔pIRES2-EGFP(摩尔数比约为10∶1)与12 μL/孔Lipofectamine2000分别用无血清、无双抗的opti-MEM稀释至250 μL并轻轻混匀室温静置5 min后，把载体和Lipofectamine2000放在一起轻轻混匀室温静置20 min后，加入到新换200 μL无血清DMEM培养液的phoenix细胞中，并前后左右振荡摇匀. 置37 ℃，50 mL/L CO2培养箱培养12 h后加入200 μL FCS和1100 μL DMEM液，18 h后观察荧光. 72 h后以1×105/孔接种24孔板，按试剂盒说明书对其中1孔进行LacZ染色，其余用于产生病毒上清.

　　1.2.4 病毒液的制备及病毒滴度测定 转染72 h后收集病毒上清，1500 r/min离心3 min，取上清-70 ℃保存. 以0.3×105/孔接种10T1/2细胞于24孔板，细胞贴壁后加入含终浓度4 mg/L polybrene 125 μL病毒上清感染10T1/2，24 h后用新鲜培养基取代感染培养基，继续培养48 h后加入150 mg/L潮霉素筛选10 d，计数抗性克隆.

　　1.2.5 基因捕获10T1/2细胞阳性克隆库的建立 接种1×105 10T1/2细胞到6孔板，过夜后加入含终浓度4 mg/L polybrene 的500 μL病毒上清感染10T1/2，24 h后以1∶4传代至10 cm培养皿，继续培养48 h后加入150 mg/L潮霉素筛选10 d至形成抗性克隆. 挑取克隆至96孔板，用移液器抽吸30～40次完全打散细胞团，放入37℃，50 mL/L CO2孵箱过夜生长后，换成150 μL /孔的新鲜培养基扩增至24孔板后1∶3传代. 1孔PCR鉴定，1孔LacZ染色，1孔扩增后常规冻存.

　　1.2.6 10T1/2细胞阳性克隆基因组DNA的提取 参考文献[8]并稍做改动. 简言之，去除24孔板培养基，每孔加入500 μL PCR裂解液(67 mmol/L Tris-HCl pH 8.8,16.6 mmol/L硫酸铵，5 mmol/Lβ-巯基乙醇，6.7 mmol/L MgCl2,6.7 μmol/L EDTA pH 8.0，1.7 μmol/L SDS,50 mg/L蛋白酶K),37 ℃放置1 h，然后80℃孵育10 min以灭活蛋白酶K. 1.5 mL EP管收集细胞裂解液. 加入2倍体积的无水酒精-70℃沉淀3 h，4 ℃离心7 500 g×10 min，弃上清，以700 mL/L 乙醇8700 g×5 min洗涤2次，超净台上干燥. 每个EP管加入100 μL三蒸水，37℃ 650 r/min过夜振荡使之溶解，测A260nm值后-70℃保存.

　　1.2.7 PCR鉴定 以LacZ染色阴性即捕获低表达基因的10T1/2细胞基因组为模板，PCR扩增LacZ部分片段. 利用primer5.0软件设计引物，上游引物18 bp： 5′-ACCCGCATTGACCCTAAC-3′;下游引物19 bp：5′-TTCAGCCATGTGCCTTCTT-3′,预计片断为560 bp. PCR反应体系：50 μL体系中含有0.25 μL taq DNA聚合酶(5 U/μL)，4 μL dNTP(各2.5 mmol/L)，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，3 μL MgCl2(25 mmol/L)，2.5 μL DMSO，2 μg提取的10T1/2基因组DNA. 以100 pg载体ROSAFARY模板为阳性对照，2 μg未感染的10T1/2基因组DNA为阴性对照. 反应条件：95 ℃预变性5 min，95℃ 60 s,55.5℃ 30 s,72℃ 60 s共35个循环后，72℃延伸5 min，反应结束后取5 μL PCR产物电泳.

　　2 结果

　　2.1 载体ROSAFARY的鉴定及线性化 ROSAFARY载体(图1)带有编码β-半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶融合序列、PGK启动子驱动的潮霉素抗性基因以及RNA拼接的受体和供体接头. 用潮霉素可筛选到整合有该载体的任何细胞，而用新霉素只能筛选到正确捕获基因编码框且该基因启动子处于激活状态的细胞. 质粒提取后用Hind III单酶切产物电泳得到577 bp和10 423 bp两条带，Dra I单酶切产物电泳得到692 bp和10 289 bp两条带(图2)，另19 bp带不可见，与理论大小一致. Dra I酶切线性化ROSAFARY后乙醇沉淀回收，电泳结果见图3，表明ROSAFARY被完全线性化. 回收的线性化ROSAFARY载体浓度为4.5 g/L,A260nm/ A280nm=1.91，可满足后续载体转染要求. 图1 基因捕获载体ROSAFARY图. SA: RNA拼接的受体; geo: β-半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶的融合序列; PGK: 磷酸甘油酸酯激酶启动子; Hyg: 潮霉素抗性基因; SD: RNA拼接的供体接头.

　　SA: RNA拼接的受体; geo: β-半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶的融合序列; PGK: 磷酸甘油酸酯激酶启动子; Hyg: 潮霉素抗性基因; SD: RNA拼接的供体接头.

　　图1 基因捕获载体ROSAFARY图(略)

　　M： DL15 000 marker;1： Hind Ⅲ单酶切;2： Dra Ⅰ单酶切.

　　图2 ROSAFARY载体的鉴定(略)

　　M： DL15 000 marker;1：Dra I酶切线性化.

　　图3 ROSAFARY载体的线性化(略)

　　2.2 潮霉素毒性实验 不同浓度潮霉素对10T1/2细胞作用见表1，以7 d杀死全部细胞确立潮霉素对10T1/2的佳用量为150 mg/L.

　　表1 不同浓度潮霉素对10T1/2的作用 (略)

　　2.3 转染phoenix包装细胞 基因捕获载体ROSAFARY和pIRES2-EGFP共转染phoenix细胞48 h后荧光显微镜观察结果显示20%～30%的细胞有绿色荧光(图4A). 72 h后LacZ染色结果显示阳性率约10%(图4B).

　　A：ROSAFARY和pIRES2-EGFP共转染phoenix细胞后48 h (倒置荧光显微镜标尺=100 μm); B：ROSAFARY和pIRES2-EGFP共转染phoenix细胞后LacZ染色结果(倒置显微镜 标尺=50 μm).

　　图4 捕获载体转染病毒包装细胞的结果(略)

　　2.4 病毒滴度测定和基因捕获10T1/2 125 μL病毒上清感染24孔板10T1/2 用150 mg/L潮霉素筛选10 d可得到13个抗性克隆(图5).本实验用含基因捕获载体的病毒感染10T1/2获得82个抗性克隆.

　　2.5 PCR鉴定及LacZ染色 以2 μg LacZ染色阴性即捕获低表达基因的10T1/2细胞基因组DNA为模板PCR，以未用病毒感染的10T1/2为阴性对照，100 pg载体ROSAFARY作阳性对照(图6).基因捕获成功的10T1/2孔及阳性对照孔出现目的条带(560 bp)，阴性对照孔未见条带. 82个10T1/2 克隆PCR排除39个假阳性后，LacZ染色5个为阳性，38个为阴性. 捕获高表达基因的克隆LacZ染色结果(图7).

　　A：细胞呈梭形，克隆中心涡旋样生长; B： 细胞呈多角形，克隆以单层接触方式生长.

　　图5 150 mg/L潮霉素筛选病毒感染10T1/2形成的形态不同的抗性克隆 (倒置显微镜标尺=100 μm)(略)

　　M：DL15 000 marker;1: 病毒感染的10T1/2; 2: 未用病毒感染的10T1/2; 3:阳性对照.

　　图6 PCR鉴定病毒感染10T1/2克隆结果(略)

　　3 讨论

　　1989年Gossler等[9]介绍了一个极具创意的方法，在ES细胞中使用随机插入突变技术进行基因诱变，并形象命名为“基因捕获” (gene trapping). 原理是利用一含报告基因(既可作为内源基因的标签，也使随后的基因克隆变得可行)的DNA载体随机插入基因组，产生内源基因失活突变，通过报告基因的表达提示插入突变的存在及突变内源基因的表达特点. 其优点可在一个实验中产生大量突变体，建立一个随机插入突变体库，通过报告基因很容易分离被捕获的基因. 此外，如基因捕获载体插入基因外显子中使基因失活可达到“基因敲除”的效果. 基因捕获载体ROSAFARY在逆转录病毒骨架两长末端重复序列之间由启动子捕获元件(SA geopA)和polyA捕获元件(PGKhygSD)两部分组成. 在插入内源基因内含子转录后剪接时SA geopA部分中SA序列可和前一外显子接头，如读码框架一致，geo和pA部分可被前一外显子的启动子激活形成lacZ和G418的融合蛋白，捕获高表达基因的阳性克隆可用G418筛选，捕获的基因序列可由3′RACE技术获得[10]. PGKhygSD 自带启动子且含潮霉素耐药基因，用以鉴定转染是否成功. 由于发生正确基因捕获的主要结果是形成LacZ与被捕获基因的融合，不同克隆之间LacZ的表达强度和分布有较大差异，一方面说明基因捕获载体的成功融合，另一方面也提示了被捕获基因的原有表达方式.

　　A：围绕细胞核并在核一侧有集中表达强度较高; B：细胞核一侧的点状分布，中度表达; C：细胞核一侧的细小点状分布，低表达; D：泛细胞质表达，强度较高.

　　图7 不同10T1/2克隆LacZ的表达强度和分布 (倒置显微镜 标尺=50 μm)(略)

　　本实验选择ROSAFARY和pIRES2-EGFP共转染PA317细胞，因为ROSAFARY所带报告基因需LacZ染色后才知转染结果，而pIRES2-EGFP自带报告基因EGFP，在蓝光激发下可产生绿光荧光，监测是否转染成功及估计转染效率更为方便.

　　潮霉素筛选形成的克隆LacZ染色阳性细胞并非全为蓝色，可能是某些细胞绕过含载体的内含子的选择性剪接导致产生野生型蛋白和β-galactosidase活性缺失[11]. 由于本研究终目的是发现干细胞分化或恶性转化相关基因，如单个靶细胞进入2个或以上病毒就可能插入基因组不同位点，将不利于后续RACE技术的开展，更重要的难以确定在干细胞分化或恶性转化过程中起作用的基因，所以需单细胞只进入1个病毒，这就要求低病毒血清感染. Chen等[12]认为以1×106个细胞种植到100 mm培养板被病毒感染药物筛选后得到200～400个抗性克隆，此感染滴度可表示一个细胞只有一个前病毒.

　　本实验选择潮霉素B 7 d全部杀死10T1/2细胞作为观察界限是因为： ①细胞第7 d才全部死亡可使感染的细胞有适当的时间表达抗性基因. ②只用7 d筛选可减少因换液次数过多造成污染机会增多. ③降低筛选浓度将筛选时间变长，既费时又使假阳性增加，并且未感染细胞与感染细胞竞争营养和生存空间. 由实验结果知,7 d内全部杀死10T1/2细胞的150 mg/L潮霉素B筛选浓度适合本实验要求.

　　本实验用潮霉素B筛选获得阳性克隆而不管被捕获的基因表达与否有利于后续研究：对分化或恶性转化前后的细胞进行LacZ染色即可发现细胞分化或恶性转化基因表达的特点. 我们用VEGF等诱导潮霉素B抗性克隆朝内皮细胞方向分化，发现其中有2个克隆的LacZ染色由阴性转为阳性(待发表). 分化或恶性转化前后LacZ染色一致则提示被捕获的基因与细胞分化或恶性转化关系不大. 此方法还可研究药物或化学试剂对细胞作用的分子机制，观察其作用前后基因表达的变化. 相对于基因芯片有随时跟踪基因表达谱和发现新基因的优点. 本实验共建立包含43个克隆的基因捕获阳性克隆库，为进一步应用基因捕获技术揭示MSC分化及恶性转化的分子机制奠定了基础.

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