Livin和Smac在流产中的研究进展

        脂盘细胞凋亡是一种组织更新方式，通过绒毛滋养细胞及蜕膜细胞的凋亡与增殖不断进行组织结构的改建，参与维持胎盘发育的全过程，滋养细胞胞浆内含有丰富的线粒体、内质网等细胞器。线粒体是细胞生物氧化和能源中心，与细胞的生命活动有密切关系，同时对各种损伤刺激极为敏感，释放促凋亡因子蛋白。反复发生自然流产的孕妇，其头3个月内的胚胎绒毛蜕膜组织中的细胞凋亡较正常早孕明显增强，凋亡主要位于细胞滋养细胞，与妊娠早期细胞滋养细胞主要表达促凋亡基因有关。随着妊娠进展，合体滋养层细胞凋亡逐渐增多，增殖减少。合体滋养层细胞凋亡率过高，可能导致激素合成能力降低，引起胎盘组织细胞增殖与凋亡的平衡紊乱，胎儿生长受限，进而导致流产。这种细胞增殖与凋亡的时空调控有赖于胎盘组织中凋亡促进与抑制因子的协调作用。抗凋亡分子和促凋亡分子两者间的平衡决定细胞的生存或凋亡。

        1. Llvin的结构及生物学功能 Livin是一种细胞凋亡抑制因子，属于凋亡抑制蛋白家族（inhibitors of apoptosis proteins，IAPs）成员，其基因位于人染色体20q13.3，全长46 kb，包含7个外显子及6个内含子。在N端含有一个高度保守的长约70个氨基酸的杆状病毒重复序( baculovirus IAP repeat，BIR)，此结构域是结合和抑制凋亡蛋白酶caspase的关键部位，也是与第二线粒体源性激活半胱天冬酶( second mitochondria -derived activator of caspases，Smac)相互结合的关键部位；C端含有一个RING-指环结构( ringfinger)，该结构域具有E3（泛素连接酶）活性，可使Smac、caspase -3、caspase -9等泛素化和降解。Livin转录产物因剪接方式不同有两种亚型Livin仅和Livin B，分别编码298和280个氨基酸。Livin昀组织分布具有明显的组织细胞选择性；在胚胎组织及胎盘组织高表达；Livin在细胞核中和细胞质内呈纤维细丝样染色。Livin仪在胎盘组织表达，Livin$在胎儿的脑、胸腺、肾和肝等组织中高表达，可能与生长发育有关。在正常成人的大多数组织中均低表达或不表达。Livin在很多人类恶性肿瘤中高表达，如黑色素瘤、膀胱癌、胰腺癌细胞系、结肠癌细胞系、非小细胞肺癌、前列腺癌细胞系，主要表达于肿瘤细胞的细胞质，也有少部分肿瘤胞核胞浆同时表达。该基因可能在肿瘤的发生发展中起重要的作用。

        2. L1Ⅵn的抗凋亡作用及其作用机制
        Livin与IAPs家族中其它成员一样，能够抑制多种刺激促发的细胞凋亡，包括病毒、感染、化疗药物、癌基因抑活药、生长因子撤除、TNF - Fas凋亡信号途径等，在IAPs家族中抗凋亡活性强，是一个早期关键调节者，能够控制凋亡的进展。目前对Livin抗凋亡作用及机制主要有如下几种观点。

        2.1 Livin直接抑制Caspase活性 Caspase蛋白是介导细胞凋亡的重要蛋白家族，大多数刺激物是通过Caspase蛋白的级联激活反应引起细胞凋亡。线粒体、细胞色素C介导的细胞凋亡、Fas介导的凋七等多条通路，都终激活Caspase -3，使其发挥切割蛋白的功能，作用于细胞质中的细胞骨架蛋白，或作用于细胞核中的DNA酶引起DNA断裂，引发细胞凋亡。Livin中的BIR结构域与Caspase结合，抑制Caspase酶的活性，尤其是抑制Caspase -3、Caspase -7和Caspase -9的活性，阻止Caspase蛋白执行蛋白切除功能，达到阻断凋亡受体介导及以线粒体为基础的凋亡途径。

        2.2 激活TAKI/JNKI信号传导途径
        Livin可与TABI结合，并进一步激活TAKl。激活由TABI/TAKl介导的MAP激酶JNKl，抑制由TNFa和ICE诱导的凋亡。

        2.3 Livin抗凋亡作用的发挥Livin通过激活Akt途径、钙离子结合蛋白等方式发挥其抗凋亡作用。

        3. Livln与流产

        3.1 Livin只在细胞滋养细胞和间质细胞高表达，在合体滋养细胞表达很低习惯性流产妇女绒毛组织中Caspase -3等的表达增高，滋养层细胞凋亡过多。细胞凋亡是卵母细胞和早期胚胎死亡的主要方式，是导致胚胎发育停滞主要原因。稽留流产的滋养层表达明显低于正常滋养层，抑制Caspase酶的作用下降，使滋养层细胞凋亡过乡，引起胚胎发育异常。在妊娠期肝内胆汁淤积症患者的胎盘组织中细胞滋养细胞、合体滋养细胞、蜕膜细胞和间质细胞中的Caspase -3的表达比正常胎盘组织中各种细胞明显增高，而Livin的表达明显降低，其抑制Caspase -3的作用减弱，胎盘组织细胞凋亡增加，细胞增殖能力降低，引发流产。在葡萄胎组织中，Livin蛋白的表达主要定位于合体滋养细胞和细胞滋养细胞的细胞核中，部分定位于细胞浆，较正常绒毛细胞表达明显增强，致细胞凋亡减少，增殖及细胞数增多。

        3.2 Cmkovic - Mertem等使用具有靶向作用的小干涉型RNA( siRNA)干预内生性Livin基因的表达RNA( siRNA)干预内生性Livin基因的表达，使Livin基因沉默，从而能明显增加肾癌细胞对不同凋亡刺激物的反应，表现为使用阿霉素、紫外线照射TNFa等凋亡促进剂治疗后，肾癌细胞凋亡率大大增加。有学者将此方法作用于IoVo（结直肠癌细胞株）和SPCA（肺癌细胞株），发现Livin基因沉默后，肿瘤细胞的体外扩增和体内致癌能力均显著降低，而且敲除Livin基因，使得细胞停留在细胞周期的C，I，G期，肿瘤细胞终发生凋亡并且化掌敏感性增强。由此可见，siRNA介导的Livin基因沉默不仅具有很强的抗癌活性，而且能提高肿瘤细胞的化学敏感性。

        4. Smac的结构及生物学功能 Smac也称作DIABLO，是一种线粒体促凋亡蛋白，其基因定位于12q24，是目前发现的存在于哺乳动物细胞中直接抑制IAPs的蛋白。Smac有两种存在形式：全长度Smac（Smac前体）和成熟Smac。Smac前体仅局限于线粒体膜上，Smac前体分子转运至线粒体内后被剪切形成成熟Smac，成熟Smac含有184个氨基酸，N末端四肽序列Ala.Val-Pro-Ile( AVPI)，能与BIR结构域结合抑制IAPs的功能。成熟的Smac以二聚体的形式存在于线粒体的膜间隙，在凋亡诱导因子的作用下释放进入细胞质。Smac在正常细胞中不诱发凋亡，只在受损的细胞中才促其凋亡。Smac可在人类多种组织中表达，人睾丸中表达高，在心脏、肝、肾、脾、前列腺、卵巢中次之，脑、肺、胸腺和外周血淋巴细胞低表达，但在胚胎组织中的表达情况罕见报道。

        5. Smac的促凋亡作用及其作用机制
        Smac蛋白的促凋亡作用是通过逆转IAPs的作用而实现的，由受体介导、线粒体激发两条途径来完成。

        5.1 线粒体途径的作用 当受损细胞内线粒体接受凋亡信号盾，它与细胞色素C-同释放到细胞质中，直接与Livin的BIR结构域特异性结合Smac/Livin复合物，使Livin的BIR功能区失去活性，抑制Livin与Caspase的结合，从而解除IAPs对Caspase -3、7、9等的抑制作用，三种Caspase先后相继被激活并发生Caspase的级联放大效应，从而加速凋亡。Smac可与多种IAPs，包括XIAP、cIAPl、cIAP2、ML. IAP、Survivin和Livin相互作用。肿瘤细胞中高表达的Smac能增强瘤细胞对凋亡刺激的敏感性。

        5.2 受体介导的凋亡途径中的作用
        细胞膜上的死亡受体DR4、DR5与Apo - 2L/TRAIL结合后，招募接头蛋白FADD，使Pro -Caspase -8聚集，Caspase -8前体自我激活，激活的Caspase -8剪切Bid为tBid，tBid结合bax转位至线粒体，引起Smac的释放到细胞浆中，Smac蛋白再与IAPs结合并消除后者Caspase -3活化的抑制，继而激发凋亡。线粒体释放Smac蛋白是凋亡的共同特征，Smac蛋白将凋亡发生的受体途径和线粒体激发途径有机地结合起来。

        6. Smac与流产 Smac广泛表达于正常组织中，而在多种肿瘤细胞中的表达明显下降。可能在正常绒毛细胞表达降低，致细胞凋亡减少，增殖及细胞数增多，而流产组织细胞中表达上升，致细胞凋亡增加，导致流产。

        7 Llvin与Smac的相互关系

        7.1 Smac抑制Livin抗凋亡作用 Livin在正常子宫内膜表达微弱，Smac表达则强。而在子宫内膜异位症的内膜组织中，Livin与Smac的表达相反，强度呈明显负相关哺1。Smac可下调Livin的抗凋亡活性，它直接与Livin的BIR结构域特异性结合成Smac - Livin复合物，使Livin的BIR功能区失去活性，抑制Livin与Caspase的结合，从而下调其抗凋亡活性四1。因此存在着由Smac介导的Livin抗细胞凋亡作用的负性调节机制。人类IAPs具有独特的分子结构，其家族成员含有1-3个BIR结构域，BIR是IAPs和Caspase结合的结构基础，同时也是和Smac结合的结构基础。Smac通过与IAPs的BIR结构域结合，解除IAPs对Caspase-3的抑制，激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡。

        7.2 Livin通过泛索一蛋白酶体途径促进Smac降解
        细胞内有两个蛋白降解级联反应：一个是细胞凋亡过程的Caspase途径；另一个是泛素系统，E3（泛素连接酶）是泛素系统关键酶之一。实验证明IAPs的RING结构具有E3活性，、二个BIR结构抑制C端RING结构的活性。Smac与BIR结合可能有利于暴露RING结构，提高E3活性。Livin能通过BIR结构与Smac结合，促使Smac经泛素一蛋白酶体途径降解，降低Smac表达水平，抑制细胞凋亡。将野生型Livin、BIR点突变的Livtn(Livin -C．124A)及去除RINC结构的Livin( Livin - AedNO)一种载体分别和Smac -起导人Hela细胞，当没有MGl32（蛋白酶体抑制剂）存在时，表达野生型Livin细胞中Smac的表达水平较其他两组明显降低；当存在MGl32时，在三种细胞中Smac的表达水平相似。这说明：①Smac由野生型Livin降解，而不是由BIR或RINC结构所降解；②Livin促进Smac降解是经蛋白酶体介导进行的。在表达野生型Livin的Hela细胞中，Smac变成了多聚泛素蛋白链，而表达BIR突变或RINC突变的细胞申，Smac几乎不被泛素化，说明Livin介导的Smac泛素化有赖于BIR和RING结构共存，二者缺一不可，Livin的BIR结构和Smac的结合使RING构象发生变化，增强其E3泛素连接酶活性，促进Smac泛素化及降解。

        7.3 Smac促使Livin自身泛素化但不促使其降解
        用Smac和cIAPl、cIAP2、XIAP、Livin共同转染Hela细胞，结果转染cIAPl或clAP2的细胞不仅表达全长cIIAPl或elAP2，而且也表达以大分子为特征的泛素化产物，并且在成熟Smac表达的情况下，cIAPl和clAP2蛋白水平明显下降。与cIAPl和cIAP2相似，Smac也可促使XIAP和Livin泛素化，但其泛素化多为单泛素化而不是多泛素化，因而不能有效地促使其降解。

8 问题与展望 Livin作为IAPs家族的新成员，通过多种途径抑制细胞的凋亡，较其他的IAPs具有更为特殊的地位。Smac是新发现的促凋亡蛋白，在细胞的各凋亡途径中均起作用，其促凋亡作用已得到广泛承认。在肝癌、肺癌、鼻炎癌组织中，Smac与Livin的蛋白表达均为负相关，存在着相互拮抗。抗凋亡蛋白Livin和促凋亡蛋白Smac在胎盘组织细胞凋亡中，相互调节的复杂关系，尚有待于进一步研究探讨。研究Livin写Smac在稽留流产中的表达情况 及其相互关系，将有助于阐明稽留流产的发病机理，并为稽留流产的基因治疗提供新的思路。